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技术文章
谷氨酸合成酶（GOGAT）测试盒
点击次数：3512 发布时间：2020/11/16 10:35:03
测定意义：
GOGAT 广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成 GS/GOGAT 循环，参与氨同化的 调控。
测定原理：
GOGAT 催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时 NADH 氧化 生成 NAD+，340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。
谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）试剂盒说明书
微量法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GOGAT 广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成 GS/GOGAT 循环，参与氨同化的
调控。
测定原理：
GOGAT 催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时 NADH 氧化
生成 NAD+，340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提
取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂二中加入 18mL 试剂一充分溶解混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物
种）水浴 5min；现配现用；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm
处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
GOGAT 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT（nmol/min/104
cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.642×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：
比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总
数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GOGAT（nmol/min/104
cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.286×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：
96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总
数，500 万。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
