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技术文章
新生隐球菌染料法荧光定量 PCR 试剂盒
点击次数：3745 发布时间：2020/1/3 9:17:50
产品及特点 新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是深部感染真菌中隐球菌属的主要菌种之一，种类较多，广泛分布于自然界，例如受动物污染的土壤，检出率较高。由于肿瘤及化疗药物的使用、艾滋病的流行、移植术后免疫抑制药物的使用等原因，新生隐球菌的发病率越来越高，在国外已成为艾滋病患者常见的并发症之一，也是导致患者死亡的重要原因，在我国新生隐球菌的发病率也呈逐年增加的趋势，因此快速检测新生隐球菌具有重要意义。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测新生隐球菌的试剂盒，它具有下列特点：1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。2. 特异性高，引物是根据新生隐球菌高度保守区设计,不会扩增其他微生物。3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。5. 一管式操作，荧光PCR 检测，不容易产生环境污染。6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的荧光定量 PCR。
规格及成分 成分 编号 十孔盒包装
2×qPCR MagicMix 90408 0.5 mL（棕色）
荧光PCR 专用模板稀释液 180701 1 mL（黄盖）
新生隐球菌 PCR 引物混合液 14-45600yw 100 μL（白盖）
新生隐球菌 PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) 14-45600pc 50 μL（红盖）
天净沙 DNA 释放剂试用装 61202 20 次（1mL，绿盖）
使用手册 14-45600sc 1 份
运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。3. 在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提
供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备
7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果需要使用本试剂盒自带的免 DNA 提取天净沙核酸释放剂试用装，则到公司网站 www.tiandz.com 输入产品名称天净沙核酸释放剂或产品编号 61202 下载使用手册并按手册操作。
三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量检测，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性检测，则 6 个标准曲线样品只做其中 1 个（比如选择第 4 号），样品数为 N+4。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。四、荧光定量 PCR 反应参数 五、数据处理12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
