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技术文章
非洲猪瘟病毒实时荧光 PCR 检测试剂盒使用说明书
点击次数：3676 发布时间：2019/12/24 10:41:06
【用途】
本试剂盒采用实时荧光 PCR 方法检测猪全血、
血清、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肺、肌肉等样
品及环境样品中非洲猪瘟病毒（ASFV）的 DNA，
适用于 ASFV 的检测、诊断和流行病学调查。
【原理】
提取样品DNA 作为模板，以引物为起点合成与
DNA 模板互补的新链，在热启动 Taq 酶的作用下，
经高温变性、中温退火及延伸的循环，使特异DNA
片段的拷贝数放大一倍，经荧光素标记的探针与扩
增的 DNA 杂交，利用 Taq 聚合酶的 5＇→3＇外切活性，
使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，发出特异
性荧光信号，利用荧光 PCR 仪检测特异性荧光信号，
根据样品Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结
果。
【试剂盒组成】
组成
50 头份
贮藏条件
阴性对照
1 mL
-20℃
阳性对照
600 µL
无菌无核酸酶水
600 µL
PCR 反应液
600 µL
荧光探针
105 µL
说明书
1 份
【需要自备的器材】
1. 试剂：核酸提取试剂。
可调移液器（2µL、20µL、200µL、1000µL）。
3. 耗材：荧光 PCR 专用反应管、吸头（10µL、200µL 、
1000µL）。
【使用注意事项】
1. 建议与世纪元亨提供的柱式 DNA 核酸提取试剂
盒配套使用。
2. 实验过程中进行阴性对照和阳性对照样品的质
量控制，需进行提取，建议提取用量分别为
100µL。
3. 所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染实
验室。
4. PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。
流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严禁
器材和试剂倒流。
5. 所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各
试剂管使用前应完全融化，8000rpm 离心 15s，
使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时
移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即
放回-20℃。
6. 注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效
期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
7. 严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过
程中移液、定时等全部过程必须精确。
8. 反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配
制，整个实验过程严格控制污染。
9. 反复冻融试剂将降低检测灵敏度，本试剂盒应在
3 次内用完。
【样品采集】
病死或扑杀猪，取脾脏、淋巴结、肾脏、扁桃
体、肺、肌肉等；待检活猪，用注射器取血 5 mL；
或采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水等环境
样品。2～8 ℃保存，送实验室检测。（要求送检病料
新鲜，严禁反复冻融。）
【实时荧光 PCR 操作】
设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为 N，
则反应体系配制如下：
试剂
体系
无菌无核酸酶水
6.3×（N+1）µL
PCR 反应液
10×（N+1）µL
荧光探针
1.7×（N+1）µL
将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个
反应管中各 18 µL。
分别取 2 µL 模板 DNA，加入相应反应管中，
混匀并作好标记。在荧光 PCR 扩增仪上进行以下反
应：95 ℃ 2 min；循环 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共 40
次，每次循环的第二步（60 ℃ 35 s）收集荧光信号
（报告基团“FAM”，淬灭基团“None”）。
【结果判定】
1. 结果分析条件设定
阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对
照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情
况进行调整。
2. 结果描述及判定
阳性对照Ct 值＜30 并出现特异的扩增曲线，阴性
对照无Ct 值且无特异的扩增曲线，实验结果成立。被
检样品Ct 值＜35 并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪
瘟病毒核酸阳性；无Ct 值且无特异的扩增曲线， 判
为非洲猪瘟病毒核酸阴性；35≤Ct 值＜40 并出现特
异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸疑似，对疑似
样品，需重新取样提取 DNA，进行复检，Ct 值＜
40 判为阳性，否则判为阴性；对于某些未呈现S 型
曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。
【规格】50 头份/盒
【保存及有效期】于-20℃以下保存，有效期为 12
个月
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
