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技术文章
狷羚疱疹病毒1 型染料法荧光定量PCR 试剂盒
点击次数：3705 发布时间：2019/9/9 9:30:57
产品及特点 狷羚疱疹病毒1 型(Alcelephine Herpesvirus 1，AlHV-1) 会引起肉牛恶性卡他
热病，自然感染的情况下，主要是牛容易发生该病，尤其是1～4 岁的牛比较容易发生，
而老龄牛和幼龄牛相对比较少发病。病牛往往突然出现高热，体温升高达到41- 42℃，
呈稽留热，且体质迅速虚弱，接着眼、口、鼻黏膜很快出现严重炎症。双眼不停流泪，
眼脸发生肿胀闭合，且有纤维素性脓性分泌物流出，角膜发生混浊，甚至形成溃疡，最
终导致失明。这一疾病对养牛业造成巨大危害，因此狷羚疱疹病毒1 型的快速准确鉴定
对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的狷羚疱疹病毒1 型染
料法荧光定量PCR 检测试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据狷羚疱疹病毒1 型保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够50 次20μL 反应体系的荧光定量PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
规格及成分 成分 编号 十孔盒包装
2×qPCR MagicMix 90408 500μL（棕色管）
荧光PCR 专用模板稀释液 180701 1 mL（黄盖）
狷羚疱疹病毒1 型PCR 引物混合物 14-87400yw 100μL（白盖）
狷羚疱疹病毒1 型PCR 阳性对照
(1×10E8 拷贝/μL)
14-87400pc 50μL（红盖）
DNA 病毒裂解液（试用装） 3674a 15 次（9 mL）
使用手册 14-87400sc 1 份
运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法 一、稀释PCR 阳性对照（以10E2-10E7 拷贝/μL 这6 个10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万
不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，
本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA 片段作为阳性对
照。
2. 标记6 个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。
4. 在7 号管中加入5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1 分钟，得
1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6 号管中加入5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，
充分震荡1 分钟，得1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5 号管中加入5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到5 号管中，充分
震荡1 分钟，得1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA 的制备
8. 如果有N 个样品，必须设置N+2 个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），
一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL 上步制备的PCR 阳性对照的第4
号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于1 万拷贝）或第5 号（浓度为1×10E5
拷贝/μL，10μL 相当于10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求
的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL 样品，
则PC 和NC 的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA 提取试剂盒兼
容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout 或其升级版柱式病毒DNAout。本
试剂盒免费赠送15 次一管式病毒DNAout载。
三、设置qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1 次重复，则标记N+9 个PCR 管，其中N+2 个用于上步得到的N+2 个
样品，1 个用于PCR 阴性对照，6 个用于PCR 阳性对照。如果做2-3 次重复，则
反应设置数量相应增加2 或3 倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕
后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分
样品管
N+2 个
PCR 阴性
对照管
PCR 阳性
对照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix
（棕色管）
10 μL 10 μL 各10 μL
狷羚疱疹病毒1 型PCR
引物混合液（白盖）
2 μL 2 μL 各2 μL
自备10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各2 μL
N+2 待测样品DNA 模板 6 μL 不加 不加
第7 步所得PCR 阳性对照
稀释液（2-7 号）
不加 不加
各6μL（2 号样到
2 号管，3 号样到3
号管…）
注:仅ABI7500、7700 和7900 仪器需要使用ROX 作为对照，其他荧光PCR 仪
器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
3000、RotorGene 6000 和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR 参数可以根据仪器不同而自行
优化）。
过程 温度 时间
预变性 92℃ 5 分钟
PCR 反应
（30 个循环）
92℃ 60 秒
58℃ 60 秒
74℃ 60 秒
13. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA 时，
最大吸收光谱在471 nm，结合DNA 时的最大吸收光谱在500 nm，最大发射光
谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct 值为纵
轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的
log 值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct 必须大于或等
于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于
30。对待测样品，如果其Ct 大于或等于40 则为阴性，如果小于或等于35 则为
阳性。如果在35-40 之间，则重复一次。重复实验的Ct 值如果大于或等于40 则
为阴性，如果小于40，则为阳性。
关联产品 狷羚疱疹病毒1 型LAMP 恒温检测试剂盒
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原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
