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技术文章
芝麻源性成分探针法荧光定量 PCR 试剂盒
点击次数：3743 发布时间：2019/8/29 9:28:05
产品及特点本试剂盒可用于检测食品或其他材料中是否有芝麻的成分。现代食品加工工艺极大改变了食材原有的味道、气味、色泽、纹理和质地等特性，因此传统的感官鉴别技术已经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。同时部分食材还有致敏性，因此基于基因检测的快速灵敏的食材来源检测技术将对食品监管和安全提供重要的保障。本产品就是为满足这一需求根据探针法 qPCR 原理开发的产品，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2.根据芝麻保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的芝麻成分，但不能检测其他非芝麻成分。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5.快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。
6.对混合样品中芝麻成分的检测下限为 0.01%，对样品中芝麻成分的核酸检测下限为 0.1ng/µL。
7.本只能用于科研，足够 50 次 20uL 体系的荧光定量 PCR。
规格及成分成分编号十孔盒包装（去纸托）
2×Probe qPCR MagicMix904080.5 mL（棕色）
荧光PCR 专用模板稀释液1807011 mL（黄盖）
芝麻源性成分探针法 qPCR
引物混合液15-147yw100 uL（白盖）
芝麻源性成分探针法 qPCR 阳性
对照（1×10E8 拷贝/uL）60908-147pc50 uL（黄盖）
天净沙核酸释放剂试用装6120220 次（1mL，绿盖）
使用手册15-147sc1 份
运输及保存低温运输，-20℃保存，有效期一年。使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较
高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。最好在专门的区域操作。
自备试剂DNA 模板
使用方法一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标
准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备
7.用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8.如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的天净沙核酸释放剂试用装，
三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9.如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品（也充当 PCR 阳性对照）。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分样品管PCR 阴性标准曲线
N+2 个对照管样品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix10 μL10 μL各 10 μL
芝麻源性成分探针法qPCR 探针1 μL1 μL各 2 μL 5 μM
芝麻源性成分探针法 qPCR2 μL2 μL各 2 μL 引物混合液
待测样品 DNA 模板7 μL不加不加
第 7 步所得标准曲线样品稀释液各 7μL（2 号样到 2
（2-7 号）不加不加号管，3 号样到 3 号
管…）
四、qPCR 反应参数
过程温度时间
预变性94℃5 min
PCR 反应
（35 个循环）94℃0.5 min
60℃0.5 min（采集 FAM 通道的荧
光信号）
72℃0.5 min
最后延伸72℃10 min 五、数据处理 11.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。 12.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则 为阴性，如果小于 40，则为阳性。
最后延伸72℃10 min 五、数据处理 11.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。 12.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则 为阴性，如果小于 40，则为阳性。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
