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技术文章
转基因元件 tE9 探针法荧光定量 PCR 试剂盒tE9 Probe PCR Kit
点击次数：3807 发布时间：2019/8/29 9:22:21
产品及特点tE9（E9 terminator）是从豌豆中克隆得到的核酮糖-1，5 二磷酸羧化酶 E9 的终止子，是转基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因，因此本公司根据探针法qPCR 原理开发了专门用于检测转基因元件 tE9 的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2.根据tE9 保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的 tE9 成分，但不能检测其他非tE9 成分。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5.快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。
6.本只能用于科研，足够 50 次 20uL 体系的探针法荧光定量PCR。
规格及成分成分编号十孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix1903030.5 mL（本色盖）
荧光PCR 专用模板稀释液1807011 mL（黄盖）
转基因元件tE9 探针法qPCR引物混合液25-2750yw100 uL（白盖）
转基因元件tE9 qPCR 探针25-2750pb50 uL（棕色管）
转基因元件tE9 探针法qPCR 阳性对照
（1×10E8 拷贝/uL）60908-
2750pc50 uL（黄盖）
天净沙核酸释放剂（试用装）6120220 次（1mL，绿盖）
使用手册25-2750sc1 份
运输及保存低温运输，-20℃保存，有效期一年。使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较
高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。最好在专门的区域操作。
自备试剂DNA 模板
使用方法一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本
试剂盒的其他成分）。
1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）
3.在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，
充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备
7.用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8.如果有N 个样品，则需要进行N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的天净沙核酸释放剂试用装
三、设置qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于PCR 阳性对照（用第一步稀释得到的标准曲线系列稀释液的第 4 号做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分样品管
N+2 个PCR 阴性
对照管标准曲线
样品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix10 μL10 μL各 10 μL
转基因元件tE9 探针法qPCR 探
针1 μL1 μL各 1 μL
转基因元件tE9 探针法qPCR 引
物混合液2 μL2 μL各 2 μL
N+2 个待测样品 DNA 模板7 μL不加不加
超纯水不加7 μL不加
第 7 步所得标准曲线样品稀释液
（2-7 号）
不加
不加各 7μL（2 号样到 2
号管，3 号样到 3 号
管…）
四、qPCR 反应参数
过程温度时间
预热50℃2 min
预变性95℃10 min
PCR 反应
（50 个循环）95℃15sec
60℃1min（采集 FAM 通道的荧光信号）
五、数据处理
11.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。
12.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则
为阴性，如果小于 40，则为阳性。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
