产品及特点肠道病毒 71 型（Enteric Virus-71，EV-71）是引起婴幼儿手足口病主要病原体之一，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统疾病。手足口病感染初期患者表现为低热、流涕、食欲下降、口痛、呕吐、腹泻等。口腔黏膜出现小疱疹，在口腔病变的同时皮肤可以出现斑丘疹，以手足为多见，皮疹主要分布于手背、指间，该病多发生于 5 岁以下儿童，1～2 岁幼儿发病率最高，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于 PCR 原理开发。它具有下列特点： 1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。 2.根据肠道病毒 71 型的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。 3.基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以达到至少 1000 拷贝/反应。 4.使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。 5.本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。 规格及成分成份编号十孔盒包装 2×qRT-PCR 缓冲液190101a500 μL（棕色管） 10×qRT-PCR 酶混合液190101b100 μL（红盖） ROX 染料I190101c50 μL（棕色管） ROX 染料 II190101d50 μL（棕色管） 荧光PCR 专用模板稀释液1807011mL（亮黄盖） 肠道病毒 71 型 RT-PCR 引物混合液14-52900yw100 μL（白盖） 肠道病毒 71 型 RT-PCR 阳性对照 （1×10E8 拷贝/μL）14-52900pc50 μL（黄盖） 天净沙核酸释放剂试用装6120220 次（1mL，绿盖） 使用手册14-52900sc1 份 运输及保存低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需 要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 DNA 片段作为阳性对照 自备试剂样品 RNA 使用方法一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩 散传染性病原。
1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
2.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
3.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
4.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
5.如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
6.用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的天净沙核酸释放剂试用装，其使用手册可以从本公司网站 www.tiandz.com，通过搜索产品名称天净沙核酸释放剂或产品编号 61202 下载。
三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
7.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。
8.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设
置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分N+2 个制备
所得样品RT-PCR
阴性对照RT-PCR 阳性
对照（2-7 管）
2×qRT-PCR 缓冲液10μL10μL各 10μL
口蹄疫病毒 RT-PCR
引物混合物2μL2μL各 2μL
50×ROX (见注)0.4μL0.4μL各 0.4μL
样品制备所得 RNA 模
板（来于第 8 步）5.6μL不加不加
稀释所得 6 个阳性对照
（来于第 6 步）
不加
不加各 5.6μL（2 号样到 2 号管，3 号样
到 3 号管…）
10×qRT-PCR
酶混合液2μL2μL2μL
注:需使用 ROX 染料I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research
的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。
9.上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因
仪器不同而需优化）。
四、数据处理
10.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
11.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于
或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等
于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大
于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
关联产品肠道病毒 71 型可视化 RT-LAMP 检测试剂盒
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
