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技术文章
新推出热启动Bst4.2系列——LAMP扩增检测进入新的高度！
点击次数：3293 发布时间：2023/3/17 9:35:52
| 基于自身分子酶进化技术平台（In silico Design & in vitro Evolution Workflow），并持续聚焦LAMP恒温扩增技术，新升的Bst4.2系列，将LAMP扩增技术推入了新的高度。热启动Bst4.2系列在保持Bst4.0 通扩的能力的基础上，全系包含热启动Aptamer，该配体确保酶在<30℃时，酶活封闭效率>95%,在>60℃时1min内酶活全释放。现阶段，热启动HotStart Bst4.2 Polymerase为已知的LAMP扩增用酶，与普通LAMP扩增体系相比它有绝对的优势。 | ||||||||||||
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实例性能展示 | ||||||||||||
| 1、Bst 4.2热启动性能展示 采用荧光酶活测定法在30℃和60℃条件下测定HotStart Bst 4.2，结果显示与未加入Aptamer的对照比较来看。HotStart Bst 4.2在30℃条件下酶活几乎无活性，而60℃条件下1min内酶活全释放，恢复100%活性。 | ||||||||||||
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| 2、以Bst 4.2 SYBR Green试剂进行标准LAMP和eLAMP扩增比较 以human Total RNA为模板，采用RnaseP LAMP Primer进行标准LAMP和eLAMP 扩增。在25ul扩增体系中加入10ng、1ng和0ng的RNA，70℃反应40min。从扩增结果可获得，在Helicaser的加持下F3/B3可全去除，对扩增速度几乎无影响，并且非特异性扩增得到改善。 6 Primer LAMP引物浓度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM; F3/B3=0.1 μM。 4 Primer eLAMP引物浓度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM。 | ||||||||||||
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| 3、以Bst 4.2 Basic试剂进行DP-eLAMP探针法扩增 在众多的探针法LAMP测试中，DP-LAMP探针法(Displaceable Probe LAMP)为推荐的使用方法（参考PMID: 33626039）。在LAMP扩增中将LF或LB引物退火至互补的猝灭oligo，利用链置换活性获得游离的荧光信号（可参考3831-21说明书资料）。该方案可进一步降低LAMP的非特异扩增。下图为DP-eLAMP进行三种荧光标记探针的实验数据。结果显示HotStart Bst4.2总能获得高特异性和高重复性的扩增。 | ||||||||||||
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| 4、以Bst4.2 L-HNB 试剂进行L-HNB (紫罗兰-淡绿) 变色反应（肉眼观察） 以2019-nCoV体外转录RNA为模板，采用eLAMP扩增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 对10000、1000、100、25copies/管的阳性RNA进行检测，ddH20为阴性对照（4重复）。下图为70℃反应30min 后的检测结果。结果表明L-HNB法获得清晰易于区分的颜色变化，易区分阳性和阴性扩增。 | ||||||||||||
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| 5、 以Bst4.2 L-HNB (紫罗兰-淡绿) 变色反应对反应缓冲盐Tris的耐受性测试 以2019-nCoV体外转录RNA为模板，采用eLAMP扩增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 对1000copies/管的阳性RNA进行检测（2重复），ddH20为阴性对照（2重复）。下图为70℃反应30min 后的检测结果。结果表明L-HNB法，在1x浓度下可耐受10mM Tris-HCl的缓冲盐，阳性样本仍然可以充分的变色。该变色方法不受样本中缓冲盐影响。 | ||||||||||||
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| 6、 以Bst4.2 Red试剂进行LAMP红黄变色扩增 以2019-nCoV体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、104和106Copy，NTC为ddH2O为模板。上图为加样结束反应起始，下图为70℃反应30min后。 | ||||||||||||
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| 7、 以Bst 4.2 Basic试剂搭配 OG 橙绿变色反应管（A3821） 以2019-nCoV体外转录RNA为模板，1-6分别为1、10、100、1000、104和106Copy，NTC为ddH2O为模板。上图为加样结束反应起始，下图为70℃反应30min后。 | ||||||||||||
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原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
