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技术文章
利用PCR分析酵母菌落
点击次数：3834 发布时间：2019/4/30 8:23:53
实验方法原理
用 PCR 分析酵母菌落时，无需纯化 DNA。本方案以单个酵母菌落的粗裂解液作为 PCR 扩增的模板，来确定酵母中是否携带目的 DNA 序列。
实验材料Taq DNA 聚合酶寡核苷酸引物DNA 标准参照物YAC 重组子的酵母菌株
试剂、试剂盒PCR 缓冲液dNTP 溶液
仪器、耗材琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶微量离心管程控式 PCR 仪
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
10X 菌落 PCR 缓冲液
dNTP 溶液（10 mmol/L), 含有 4 种 dNTP ( pH 8.0，PCR 级）
MgCl2 ( 25 mmol/L)
2. 酶及其缓冲液
Taq DNA 聚合酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶
4. 核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物
DNA 标准参照物
5. 专用设备
微量离心管（0.5 ml)
储存有所需 PCR 方案的程控式 PCR 仪
6. 载体和酵母菌株
携带有目的 YAC 重组子的酵母菌株
二、方法
1. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管里，依次序加入下列物质：10X 菌落 PCR 缓冲液 2 ul，25 mmol/L MgCl2 1.2 ul，10 mmol/L dNTPs 0.4 ul，寡核苷酸引物 每个引物浓度为 10 pmol，Taq 聚合酶 5 单位（0.2 ul），H2O 加至总体系为 20 ul。
2. 用一个黄色的一次性移液器吸头，吸取少量酵母菌落 ( 0.10~0.25 ul )，加入反应体系。
3. 将 PCR 管放进 PCR 仪内。按下面程序进行 PCR 反应。
4. 用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 PCR 产物。电泳应采用适宜大小的标准参照物。
收起
注意事项
1. 设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。
2. 使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
