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技术文章
原代细胞培养难？金牌实验员来支招
点击次数：3899 发布时间：2018/10/17 9:08:06
长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。
「养细胞难、养原代细胞更难、养原代神经干细胞难上加难！」
今天，彩佑金牌实验员为大家详细讲解原代神经干细胞取材及培养的那些事，手把手教你轻松搞定~
步骤一. 原代取材：
1. 脱颈处死 2 周龄孕鼠，孕鼠腹部以 75% 酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷 PBS 液的 10 cm 培养皿中。
2. 将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。
3. 将脑组织用 PBS 清洗三次，剪成 1 mm3 大小的组织块，至于含 DMEM/F12 的离心管中，吸管轻吹打 10 次，静置离心管 1~2 min，取细胞悬液。重复 2-3 次。
4. 细胞悬液以 700r/min 离心 6 min, 吸除上清，获得细胞沉淀。用 (DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20 mg/ml+EFG20 mg/ml) 重悬后，过 200 目筛网，并计数。
5. 按 5×105/ml 密度接种，置于 37℃，5%CO2 培养。2 天后隔天换液。通常一周左右，神经球长出。
步骤二. 传代培养：
1. 在光镜下观察细胞球中心已出现灰黑色区域时进行传代，将培养基转移至 15 ml 离心中，800r/min 离心 5 min，弃上清。
2. 加入 0.125% 胰酶+0.02%EDTA 消化 2-3 min，加入胰酶抑制剂终止消化，轻轻吹打神经球至至细胞悬液， 800r/min 离心 5 min，弃上清。
3. 加入适量干细胞培养液 Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），调整细胞浓度为 5×105/ml，置于 37℃，5%CO2 继续传代培养。
实验影响因素
1. 供体年龄的影响
实验研究显示，胚胎鼠大脑皮质中的神经干数量明显高于新生鼠，且胎龄为 12~15d 左右的鼠胚胎体内的神经干的分化能力最强。
2. 分离方法对细胞纯度及活力的影响
常用的细胞分离方法有机械分离法和酶消化分离法。机械分离法的缺点是吹力度和次数不易掌控，且机械切割作用会使细胞活性降低；酶消化法缺点是消化的时间不易掌握，并且用于分离神经干细胞的消化酶对细胞具有潜在的损害作用。
3. 接种密度对神经干的影响
神经干细胞的适宜接种浓度一般可用 1×10*8/L~1×10*9/L，接种细胞密度过小，细胞不成球，不利于细胞增殖；接种细胞密度过大，第一次传代后很快出现死亡、特大、散乱、单细胞数迅速增多。采用半量换液的方法可以最大程度地使细胞生存环境保持稳定, 有利于细胞生长。
4. 传代培养时机的影响
神经干细胞经过原代培养后中，细胞数量大量增殖，必将导致大部分神经干细胞因缺乏营养而死亡，因此及时进行传代是防止其死亡的关键，有文献报道一般选用原代培养 5~7 d 时进行，既可避免细胞过度增殖而死亡, 又保持细胞增殖的活性。
注意事项
1.为维持取材过程中的细胞活性，在取材整个过程中应都在冰上进行并且在剥离脑膜和血管组织中要在含有10%FBS高糖培养基中，因为胎鼠神经干代谢旺盛，长时间在无糖环境对神经干造成损伤。
2.在取材过程中，不要取一个皮层，剥离一个脑膜血管，而是快速将所有胎鼠皮层取下来，放到高糖培养基中。
3.剥离脑膜及血管应全部分离干净，否则在制作单细胞悬液时，会被迫加大吹打力量和次数，造成细胞损伤。
4.在培养过程中，为防止细胞贴壁分化，隔天轻轻晃动培养基。
5.避免细胞污染。加强无菌操作意识，做好实验室、实验器械等的消毒工作。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
