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技术文章
预染蛋白marker常见问题及解决方法2023科研资料更新
点击次数：3396 发布时间：2023/2/27 9:51:16
Q1:我
Q2：我的蛋白质标准中的几个条带在凝胶上缺失。你们能帮我排查问题吗？
A2:
- *查使用的凝胶类型/凝胶百分比。可能会由于凝胶类型和/或百分比的不同而不能看到所有条带。例如，蛋白质标准品的小条带可能不能在非常低百分比的凝胶上分辨，而较高分子量条带可能不能在高百分比凝胶上分辨。
- *检查蛋白质分子量标准品的有效日期。由于蛋白质降解，过期批次可能导致条带褪色或缺失。
- *检查蛋白质分子量标准品的储存条件。不适当的储存条件会损害标准品中蛋白质的稳定性。
- *确保蛋白质分子量标准品在上样到凝胶上之未加热/煮沸。我们的蛋白质分子量标准品可直接上样，我们不建议将其加热/煮沸，因为这可能会导致标准品中的蛋白质降解。
Q3:我使用了你们的一种蛋白质标准品，并在泳道中看到了一些额外的条带。可以提供一些建议吗？
A3:
- *上样时，请注意确保相邻样品泳道没有交叉污染。
- *确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致产生额外的条带，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
- *标准品储存不当或反复冻融会导致蛋白质降解。
Q4:我使用了你们的一种蛋白质标准品进行转印，发现一些小分子蛋白质条带穿过了膜。我该如何解决这个问题？
A4:
- *降低电压、电流或缩短转印时间
- *确保转膜缓冲液的甲醇浓度合适；可使用浓度为10–20%的甲醇，从而去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，并促进蛋白质与膜的结合。
- *确保转膜缓冲液的SDS浓度合适（若加入了SDS），SDS浓度不要超过0.02–0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。
- *检查膜的孔径和靶标蛋白质的大小。小于10kDa的蛋白质很容易穿过0.45μm孔径的膜。如果您的目标蛋白质小于10 kDa，那么好使用0.2μm孔径的膜。
Q5:我在Tris-甘氨酸凝胶上使用了一种预染标准品，发现蛋白质的分子量与在NuPAGE Bis-Tris凝胶上的分子量不同。这是什么原因？
A5:预染标准品具有与每种蛋白质共价结合的染料，这将导致标准品在不同的缓冲系统（即不同的凝胶）中迁移率不同。因此，使用预染标准品进行分子量估算将仅得出蛋白质的表观分子量。预染标准品可用于分子量估算、确认凝胶迁移和估算转膜效率，但对于需要确估算分子量的应用，应使用非预染标准品。
Q6:我使用了你们的一种蛋白质标准品进行转印，发现一些高分子蛋白质条带转印到膜上的效果很差。可以提供一些提示吗？
A6:
- *增加电压、电流或转印时间
- *凝胶和SDS-蛋白质复合物中的SDS会促进蛋白质从凝胶中洗脱，但抑制蛋白质与膜的结合。这种抑制作用在硝化纤维素膜上的强度大于PVDF膜。对于难以从凝胶中洗脱的蛋白质，如大分子量蛋白质，可在转膜缓冲液中加入少量SDS以改善转印效果。我们建议在组装三明治将凝胶置于含0.02–0.04% SDS的2x转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含10%甲醇和0.01% SDS的1X转膜缓冲液进行转印。
- *甲醇可去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，促进蛋白质与膜的结合，但对凝胶本身有一些不良影响，会降低转印效率。甲醇可能导致孔径减小、某些蛋白质发生沉淀以及一些碱性蛋白质带正电荷或变为中性。应确保转膜缓冲液的甲醇浓度不高于10–20%，并使用高质量的分析甲醇。
Q7:我使用了你们的一种蛋白质分子量标准品，它的条带看起来不太明显，很模糊。我该怎么操作？
A7:
- *确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致模糊，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
- *条带在低百分比凝胶中不能很好地分辨。尝试使用更高百分比的凝胶。
- *如果在转膜/检测后条带看起来不明显和模糊，可能是由于抗体浓度过高。遵循制造商建议的稀释度或通过斑点印迹确定适抗体浓度。
Q8:我使用了你们的一种预染蛋白质分子量标准品进行转印，但是膜上的转印效果较差。可能出了什么问题？
A8:
- *凝胶上的分子量标准品的量不足： 将适当体积的分子量标准品上样到凝胶上。以下是我们的建议：(小型凝胶：每孔5μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔10μL（厚度1.5 mm）;•大凝胶：每孔10μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔20μL（厚度1.5 mm）)
- *转印不全或不理想： 优化转印条件
Q9:我使用了你们的一种预染蛋白质分子量标准品，这些条带没有很好地分离。可能是什么原因造成的？
A9:
- *样品被煮沸： 丢弃煮沸的分装样品。
- *使用的分子量标准品体积过大： 加入较少的体积或使用用蛋白质上样缓冲液稀释分子量标准品。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
