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技术文章
ELISA常见类型二 | 竞争法，五分钟搞定！2022更新
点击次数：3367 发布时间：2022/8/29 9:31:19
竞争法ELISA（也称抑制或封闭法ELISA）通过定量某种样品分析物对预计信号的干扰，来测定该分析物在样品中的含量，可通过以下方式进行：微孔板用一种分析物或一种对靶标分析物具有特异性的抗体包被（即直接法和间接法），再添加一种有部分某种检测的靶标分析物，以竞争结合抗体上的位点。信号与分析物含量呈负相关，因此，如果靶标分析物的浓度较分析物高，靶标分析物竞争性结合有限量的标记抗体，参考信号将会较靶标分析物的浓度较低的情况增强。
竞争法的理论基础是限量抗体，只有在限量抗体基础上，两种抗原才会形成竞争关系。该方法一般用来检测具有较少表位的小分子物质。
实 验 概 要
以直接竞争法ELISA为例，将特异性抗体吸附于固相载体，加入待测抗原（标准品或样本）和生物素标记的检测抗原，二者竞争与固相抗体结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，经过温育和彻洗涤后加入显色底物。显色的深浅与样品中待测物质含量呈负相关。
1) 准备所有的试剂和梯度稀释的标准品。板条加入洗液静置浸泡30 。
2) 标准品孔加入2倍倍比稀释的标准品；非特异性结合(NSB)和da结合(B0)孔加入标准品稀释液或培养基。
3) 血清/血浆：样本孔加入样本；细胞培养上清：样本孔加入细胞培养上清。
4) 除了Blank和非特异性结合(TA)孔空白，NSB孔加入1×检测缓冲液，其余每孔加入稀释的偶联物。
5) 封膜，室温孵育1小时，洗涤6次。
6) 除了TA和Blank孔，其余每孔加入稀释的HRP标记的链霉亲和素。
7) 封膜，室温孵育30分钟，洗涤6次。
8) TA孔加入稀释的HRP标记的链霉亲和素。
9) 每孔加入显色底物，避光，室温孵育5 - 30分钟。
10) 每孔加入终止液。
11) 30分钟内，在450nm波长检测OD值，参考波长570nm或630nm。
注：以上步骤是以联科生物ELISA试剂盒为参考，不同厂家的试剂盒操作步骤可能不一样，开始实验一定要仔细阅读产品说明书哦~
直接竞争法和间接竞争法的区别
1）标记
• 直接竞争法：标记抗原，与检测样品中的抗原竞争抗体；
• 间接竞争法：标记抗体，固相抗原与检测样品中的抗原竞争标记抗体。
2）模型
• 直接竞争法：包被抗体，用HRP-抗原与样本一起加入。样本中的Ag与HRP-Ag竞争Solid-Ab，固相吸附的HRP-Ag与样本中的Ag浓度成反比；
• 间接竞争法的模型：包被抗原，用HRP-抗体与样本一起加入。样本中的Ag与Solid-Ag竞争HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab与样本中的Ag浓度成反比。
3）结合机会
• 直接竞争法：标记抗原与待测抗原均是液相，与抗体的结合机会是一样的；
• 间接竞争法：固相抗原与抗体的接触面积较小，固相抗原与待测抗原的结合抗体机会是不平等的，接近顺序饱和法，即只有与待测抗原结合剩余的抗体才会与固相抗原结合。
4）系统放大
• 直接竞争法：一般难以进行放大，常用的有生物素化抗原与酶标亲和素；
• 间接竞争法：一般可以使用酶标二抗。
5）灵敏度
• 间接竞争法灵敏度大于直接竞争法。
• 由于结合机会的差异，间接法的抑制率大于直接法，从而抑制曲线斜率会大于竞争法，故灵敏度越大。在进行系统放大时，间接法一般可以使用酶标二抗，进一步提高灵敏度。
小 拓 展
竞争法ELISA也可以用来检测大分子抗原甚至是抗体。检测大分子抗原时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法灵敏度高。检测抗体时，由于两种竞争的抗体来源不一，两种抗体趋同性不高，导致检测结果的可信性不高。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
