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技术文章
人 NK 细胞无血清活化扩增方案2022更新
点击次数：3397 发布时间：2022/8/4 9:59:38
一、材料及试剂清单：
二、NK 细胞培养方案
（一） 包被
T175 培养瓶中 18ml PBS加入本试剂盒 1 支试剂Ⅰ、1 支试剂Ⅱ,4℃冰箱过夜或置于37℃ 培养箱中，至少包被2小时。
（二） 细胞制备
1. 一天
A： 抽取抗凝外周 血50ml，800g，15min 室温离心。
B：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中 56℃，30min；然后-20℃静置 10min；后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用。
C：取上述离心后下部细胞成分，加 PBS至 50ml，混匀，加到 2 个装有样本密度分离液的50mlPBMC 效离心管中，800g，15min 室温离心。
高离心管的使用：用 10 毫升移液管吸取 12.5 毫升分离液，对着效离心管隔板上的孔打进去，离心 200g,2min。建议一次分装，4 度备用，使用取出装有分离液的效离心管，恢复至常温使用。
D：取细胞层（建议将效离心管隔板上面及分离液层中所有细胞全部吸取出来）加入培 养基至 50ml，600g 10min，弃上清液。
E：分离出的 PBMC 用未加任何因子的免疫细胞无血清培养基配制成细胞悬液 40ml，加入 1 支试剂Ⅲ（5 支全部加入），加入 1 支试剂Ⅸ，加入到弃掉包被液的培养瓶中，加入 5ml 自体血浆，置于饱和湿度、37℃、5.0% CO2 培养箱中培养。
F：NK 培养液配置方法：
a） 增殖培养基的配置：在 1000ml 免疫细胞无血清培养基
中加入本试剂盒一支试剂Ⅴ。
b） 活化培养基的配置：在 500ml 增殖培养基中加入本试剂盒一支试剂Ⅳ。
注：先使用完活化培养基，再使用增殖培养基。
2. 第四天：加入 40mlNK 活化培养基，加入 5ml 血浆，加入 1 支试剂Ⅸ, 一支试剂Ⅵ。
3. 第六天：加入 70mlNK 活化培养基，加入 5ml 血浆，加入 1 支试剂Ⅸ,一支试剂Ⅶ。
4. 第八天：将培养瓶中细胞全吹打下来，加入剩下自体血浆，转移到 1 个培养袋，建议补至 500ml。
5. 第十天：视细胞生长状态，建议每个培养袋补加培养液 500ml。
6. 第十三天：视细胞生长状态，建议每个培养袋补加培养液 1000ml。送检第三方做细菌、真菌、支原体、内毒素检测同时做好自检。
7. 第十六天：收集 NK 细胞悬液 2000ml，1500rpm×5min 离心后弃去上清液，250ml 离心管集 2 管每管生理盐水 200ml 洗涤（1500rpm×8min）1 次，再用 50ml 离心管生理盐水 100ml 洗涤（1200rpm×5min）1 次，按照 200ml 生理盐水+一支试剂Ⅷ + 8ml 20%人血清白蛋白重悬细胞，封装好后送病房，同时留样封存以备日后检测。
三、注意事项
1. 试剂盒必须按规定温度保存，不可反复冻融。试剂在解冻需解冻，并充分混匀，不 可剧烈震荡。
2. 可视细胞生长的实际状况适当调整补液时间和用量。
四、实验数据
1. NK 细胞扩增数量可达 50 亿以上
2. 阳性比率流式数据
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
