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技术文章
人间充质干细胞培养方法
点击次数：3388 发布时间：2022/7/12 9:22:44
一、人间充质干细胞（脐带来源）培养流程
1.实验材料
1.1 材料：离体2小时内的健康新生儿脐带
1.2 试剂：TBD人间充质干细胞培养套装（货号：SC2013-G-KIT）
1.3 仪器：细胞培养瓶、无菌超净工作台、自动CO2恒温孵育箱、倒置生物显微镜、-80℃超低温冰箱、台式离心机、无菌不锈钢托盘、无菌镊子、无菌烧杯、无菌手术剪
2.实验方法
2.1 促贴壁试剂的使用直接使用促贴壁试剂（货号SC2013-G-C），取20ml促贴壁试剂加入T175培养瓶，轻轻摇动，在CO2培养箱中，37℃至少孵育60min（或用保鲜膜包裹涂层的培养皿/瓶 2-8℃过夜），接种弃去多余的试剂。
2.2 脐带组织间充质干细胞的分离培养
2.2.1 从手术台取正常足月产健康婴儿脐带，浸泡于生理盐水（每毫升含25U肝素钠）或组织保存液中。
2.2.2 超净台内取出脐带，PBS（货号：PB2004Y）充分洗涤残留的血液，去除两端各0.5cm长的脐带，将脐带剪成 2cm 长的小段。
2.2.3 沿脐静脉内腔纵向剪开脐带，用齿镊剥离脐静脉内膜，将覆盖动脉的华通氏胶略微剥离，顺势抽出两根动脉。剩余部分主要为华氏通胶。
2.2.4 将华通氏胶剪碎至小于1mm×1mm×1mm大小组织块，用组织镊将组织块放置于期已包被好的T175细胞培养瓶中，组织块间距1cm，盖好瓶盖，置于超净台中，放置 30 分钟-60 分钟。
2.2.5 将18ml人间充质干细胞无血清基础培养基（货号：SC2013-G-A）与2ml人间充质干细胞无血清培养基添加物（货号：SC2013-G-B）混合均匀成20mlwan全培养基，将其沿培养瓶瓶壁缓慢加入。培养基必须没过脐带组织。后缓慢移动，将培养皿或培养瓶放置于 37℃、5%CO2 、95%湿度的二氧化碳培养箱中。
2.2.6 放置在二氧化碳培养箱中的培养瓶，在7天内(7×24小时)，严禁移动。7天后，2/3 量换液，更换为新鲜全培养基（融化添加物，按10%比例加入基础培养基中，充分混合均匀，即为全培养基。），换液时应缓慢操作，切勿吹起组织块。
2.2.7 自7天后，应2天观察一次，若有组织块周围已爬出细胞，且长至半径0.5cm(即组织块周围爬出细胞的外沿距组织块边缘 0.5cm)，镜下标记，用枪头或移液管轻轻将组织块拨离，令其从培养表面脱离，漂浮于培养瓶中。在后收获 MSC 细胞，应将所有组织块去除，以便收获爬出的MSC 细胞。
2.3 间充质干细胞的传代培养
2.3.1 吸去培养液，将T175瓶内剩余的组织块去净后，加入5ml胰酶替代物（货号：SC2013-G-D）置37℃培养箱中消化1－2分钟，或室温消化3-5分钟，显微镜下观察到绝大部分细胞变圆，少量细胞贴壁仍呈纺锤形，少量细胞已经悬浮即可终止消化。注意：对于人间充质干细胞，尤其是利用该体系培养的细胞而言，其消化脱壁的时间应该较短，难以消化脱壁的细胞多数可能不是间充质干细胞，而是单核巨噬细胞等杂细胞。
2.3.2 立即加入5ml无血清胰蛋白酶终止液（货号：SC2013-G-E），用吸管吸取液体，反复吹打培养器瓶底壁，使细胞彻脱离瓶皿底壁。
2.3.3 吸出培养瓶内所有液体，水平离心（250g，10分钟），弃去上清液。
2.3.4 用2-3ml间充质干细胞的wan全培养液重悬细胞。
2.3.5 以106个细胞接种至T175培养瓶中，加入40mlwan全培养基，放置于37℃、5%CO2、95%湿度的二氧化碳培养箱中，培养72小时，培养期间无需换液补液。
注意：不可让间充质干细胞完quan融合或过度融合，否则将会导致以下问题：
（1）细胞生长接触抑制；
（2）消化后细胞成片脱落，悬液中出现团块；
（3）干细胞自发分化。这些问题将严重影响细胞的生长状态。
2.3.6 培养72小时后可收获107个细胞。
2.4 间充质干细胞的冻存
2.4.1 将培养瓶内细胞消化终止后，在室温（15-25°C）以300g离心 5 分钟。
2.4.2 轻轻吸走上清液，注意不要扰动细胞团。
2.4.3 用血清学吸管以 1ml的无血清细胞冻存液（货号：TBD698）重悬细胞。在打散细胞团时，尽量减少细胞聚集体分解。2.4.4 用 2ml的血清学吸管将 1ml的细胞聚集体转移到标记好的冻存管中。
2.4.5 用以下方法冻存细胞聚集体:推荐使用缓速降温方法，每分钟降低 1 度，随后可以在-196°C 液氮或更低的温度长保存。不推荐在-80°C 期保存。逐步降温法：使用程序将温盒-20°C保存2个小时，然后-80°C 中保存2个小时，随后可以在-196°C液氮中或更低的温度期保存。
2.4.6 无血清细胞冻存液（货号：TBD698）可冻存细胞密度为1*106-107个/ml。
2.5 间充质干细胞的复苏
2.5.1 解冻后，应该立即铺板在预先包被好的培养皿中。
2.5.2 开始之，提准备好以下材料：试管恢复至室温的培养基，预先包被的培养瓶，确保整个解冻复苏程序可以在短的时间内完成。
2.5.3 在 37°C 水浴中快速解冻，持续温和的在水中晃动冻存管，直到剩余少量细胞还处于冻存状态。
2.5.4 水浴中取出冻存管，用 70%的酒精或异丙醇擦拭除菌。
2.5.5 用 2ml的血清移液管把细胞悬液转移到一个15ml的锥形试管。
2.5.6 逐滴加入5-7ml的预热的培养基到 15ml的离心管中，加入的同时轻轻混匀。
2.5.7 室温（15-25°C）以 300 g 离心5钟。
2.5.8 吸出培养基，使细胞沉淀完好无损。使用 2ml血清移液管轻轻将细胞沉淀重悬于 1ml的培养基中。将细胞混合物转移到含有全培养基的预包被的培养瓶中。放置于37℃、5%CO2、95%湿度的二氧化碳培养箱中。
二、其他组织间充质干细胞分离方法
牙髓干细胞 （dental pulp stem cells）
1.将新鲜采集的牙齿，牙齿表面灭菌处理，置于10 cm培养皿中，用PBS清洗3遍，劈开牙冠，取出牙髓组织。
2.接着加入5ml全培养基浸润牙髓组织，用无菌手术剪将其剪碎。
3.将其剪碎组织块固定在培养皿中，于37℃、5% CO2培养箱孵育使组织块黏贴在培养皿壁上。
4.48h液，此后每3到4天更换1次全培养基。培养约10~14天会有细胞从组织块中爬出，细胞达到80%~90%后，用胰酶替代物37℃消化，再加入等体积胰蛋白酶终止液。
5.洗涤离心后，按1:3比例传代。
胎盘干细胞（placental stem cells）
1.在无菌条件下获取人胎盘组织，经PBS反复冲洗，去除胎盘血，并剪去残余脐带组织，放置于无菌方盘中待用。
2.将胎盘组织剪碎（近似肉糜）用组织镊将脐带小块放置于期以包被好的培养皿或培养瓶底面。铺片密度为1块/平方厘米，盖上培养皿或瓶盖，置于超净台中。放置 30-60 分钟。
3.将对应体积的培养基沿培养皿皿壁或培养瓶瓶壁，缓慢加入。培养基必须没过胎盘组织。后缓慢移动，将培养皿或培养瓶放置于37℃、5%CO2、95%湿度的二氧化碳培养箱中。
4.放置在二氧化碳培养箱中的培养皿或培养瓶，在7天内(7×24小时)，严禁移动。7天后，2/37量换液，更换为新鲜培养基，换液时应缓慢操作，切勿吹起组织块。
5.自7天后，应2天观察一次，若有组织块周围已爬出细胞，且长至半径 0.5cm（即组织块周围爬出细胞的外沿距组织块边缘0.5cm），镜下标记，用枪头或移液管轻轻将组织块拨离，令其从培养表面脱离，漂浮于培养瓶中。在后收获MSC细胞，应将所有组织块去除，以便收获爬出的MSC细胞。
6.用胰酶替代物37℃消化，再加入等体积胰蛋白酶终止液。
7.洗涤离心后，按1:3比例传代。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells）
1.无菌条件下取健康成人皮下脂肪约5g，放置培养皿中，经无菌PBS洗去红细胞，剔除脂肪组织中肉眼可见血管，剪碎至细小颗粒。
2.0.1%Ⅰ型胶原蛋白酶与胰蛋白酶1：1配制成组织消化液，按组织3倍体积加入进行消化。
3. 1500r/min 离心10min，去除脂肪细胞及上清液，PBS重悬沉淀，200目细胞筛无菌过滤，1500r/min离心10min，所得细胞提取物用wan全培养基重悬 .
4 以适当密度接种到培养瓶，加入适宜体积的培养基。
5. 将培养皿或培养瓶放置于 37℃、5%CO2、95%湿度的二氧化碳培养箱中。
6. 5天后次换液，之后3天换液1次，待原代细胞达85%融合时消化传代。
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
