测定意义： THL（EC 3.2.1.28）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。海藻糖酶主要功能在于生物体分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。测定原理：采用3.5－二硝基水杨酸法测定THL催化海藻糖产生的还原糖的含量。还原糖与3.5－二硝基水杨酸共热生成棕红色的氨基化合物，在定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此判断THL活性的高低。

需要的仪器，耗材:可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

样本处理

称取约 0.1g 样本，加提取液 1mL，冰上充分研磨，11000g 4℃离心 20min，取上清液待测

测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。

2、 试剂在25℃水浴锅中预热30min。

3、 按下表依次在微量石英比色皿/96孔板中加入试剂

试剂名称（μL） 空白管 测定管
蒸馏水 20
上清液 20
试剂 170 170
试剂二 10 10

迅速混匀后在 265nm 测定 10s 和 130s 的吸光值，分别为 A1、A2，用 A1 减 A2，得到ΔA 空白管、ΔA 测定管。

AAO活性计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算 AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。 AAO(U/mg prot) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×10 6÷(Cpr×V样)÷T =0.0923×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr

（2）按样本质量计算 AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。 AAO(U/g 质量) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×10 6÷(V样÷V样总×W)÷T =0.0923×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W ε：AsA在265nm处消光系数，5.42×10 4L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10 -4L； 10 6：单位换算系数，1mol=1×10 6μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间，2min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算 AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。 AAO(U/mg prot) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×10 6÷(Cpr×V样)÷T =0.1538×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr

（2）按样本质量计算 AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol AsA为1个酶活单位。 AAO(U/ g 质量) = (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×V反总×10 6÷(V样÷V样总×W)÷T =0.1538×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W ε：AsA在265nm处消光系数，5.42×10 4L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10 -4L； 10 6：单位换算系数，1mol=1×10 6μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：样本质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间，2min。

原创作者：上海仁捷生物科技有限公司