结节性硬化症蛋白1抗体操作步骤_技术交流_技术文章

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结节性硬化症蛋白1抗体操作步骤

点击次数：1149 发布时间：2026/2/6 16:21:48

结节性硬化症蛋白1抗体（TSC1抗体）的操作步骤需根据具体实验类型（如Western Blot、免疫组化IHC、免疫荧光IF等）进行标准化处理，‌关键在于抗原修复、封闭优化和特异性抗体孵育，尤其在石蜡切片中必须进行有效的抗原修复以暴露TSC1表位‌。

一、抗体准备与稀释

‌抗体来源‌：兔源多克隆抗体（Rabbit pAb），货号PK9297，浓度1 mg/ml

‌储存方式‌：

冻干粉抗体需用无菌蒸馏水或PBS缓冲液溶解；

分装为小支（如20 μl×5支），-20℃保存，避免反复冻融

‌工作液配制‌：

使用抗体稀释液（如含5% BSA的PBS）将原液稀释至所需浓度；

推荐起始稀释比：WB 1:500，IHC 1:100–1:200，具体可根据预实验优化

二、样本处理

1. 细胞样本（IF/ICC）

固定：使用4%多聚甲醛室温固定15–20分钟；

通透：加入0.1% Triton X-100 PBS溶液，室温孵育10分钟；

封闭：5% BSA或10%正常山羊血清，37℃封闭20分钟

2. 组织切片（IHC-P）

脱蜡水化：

石蜡切片依次浸入二甲苯（3×15分钟）、无水乙醇、95%、90%、80%、70%乙醇梯度水化；

蒸馏水冲洗5分钟

抗原修复（关键步骤）：

使用0.01 M枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0），微波加热或高压锅处理10–15分钟；

自然冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5分钟

三、一抗孵育

吸干组织周围液体，滴加适量稀释后的一抗工作液（50 μl/张切片）；

置于湿盒中：

4℃孵育过夜（推荐）或37℃孵育1–2小时；

孵育结束后，用PBS缓冲液冲洗5分钟，重复三次

注意：避免使用含叠氮钠的稀释液，可能抑制后续HRP标记二抗的活性。

四、二抗孵育与信号检测

封闭结束后，滴加HRP标记或荧光标记的抗兔IgG二抗；

37℃孵育30–60分钟，避光（荧光检测时）；

PBST洗涤3次，每次5分钟；

检测方式：

‌WB/IHC‌：ECL化学发光显影；

‌IF‌：DAPI复染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片，共聚焦显微镜观察。

六、注意事项

‌避免反复冻融抗体‌：分装保存，每次使用一支；

‌控制背景信号‌：优化封闭剂选择（BSA优于脱脂奶粉用于磷酸化蛋白）；

‌信号判读‌：TSC1蛋白理论分子量为130 kDa，在WB中应出现在该位置附近

参考信息显示，结节性硬化症蛋白1（TSC1）又称Hamartin，参与mTOR信号通路调控，其异常与结节性硬化症密切相关。

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