通用型DNA纯化回收试剂盒—— 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段操作步骤:
1.柱平衡步骤:向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL,12000rpm(~13400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中,称取重量。
3.向胶块中加入等倍体积溶液PC(如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100 μl,则加入100 μl PC溶液),50℃水浴放置10min左右,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。(若胶块的体积过大,可事先将胶块切成碎块)。
注意:对于回收<150 bp的小片段可将溶液PC的体积增加到3倍以提高回收率;胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱,因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。凝胶完全融解后应呈现黄色,即可进行后续操作。如果胶完全融解后溶液的颜色为桔红色或紫色,请使用10 μl 3M乙酸钠(pH 5.0)将溶液的颜色调为黄色后再进行后续操作。(溶液PC中含有pH指示剂,当pH≤7.5时溶液的颜色为黄色,此时DNA才能够有效的与膜结合,当pH值偏高时溶液的颜色变为桔红色和紫色,需要进行调整。)
4.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中),12000rpm(~13400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中。
5.向吸附柱CB2中加入600 μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm(~13400×g )离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中。
注意:如果回收的DNA是用于盐敏感的实验,例如平末端连接实验或直接测序,建议PW加入后静置2-5 min再离心。
6.重复操作步骤5
7.将吸附柱CB2放入收集管中,12000rpm (~13400×g )离心2 min,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟,彻底晾干。
注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
8.将吸附柱CB2放入一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB,(如果回收的目的片段>4 kb,则洗脱缓冲液EB应置于65-70℃水浴预热),室温放置2 min。12000rpm (~13400×g )离心2 min,收集DNA溶液。
注意:洗脱液的体积不应少于30 μl,体积过少会影响回收的效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有较大影响。若后续做测序,需使用ddH2O做洗脱液,并保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率;且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。为了提高DNA的回收量,可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中,室温放置2 min,12000rpm(~13400×g)离心2 min,将DNA溶液收集到离心管中。