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全血microRNA提取试剂盒
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详细内容
| 本试剂盒适用于冻存和新鲜的抗凝全血样本中提取血液中小RNA(<200nt),具有操作步骤简单、重复性好、产率较高的特点。核酸提取的成功与否、提取质量的好坏对后续实验起着至关重要的作用。使用TRIzol试剂提取总RNA,对总RNA中包含的部分小RNA进行研究,该方法的缺点是总RNA中microRNA的比例较小,同时由于mRNA的干扰,会导致后续反转录和RealTime PCR实验效率很低,很难获得理想的实验结果,且结果不可靠。在探索miRNA分子功能的过程中开发的全血miRNA提取试剂盒,通过一步上柱即可获得纯度高达98%的不含大RNA的miRNA,而且可在45分钟内完成小RNA的提取。每150μL全血可获得~1μg的microRNA。 保存:室温可保存2年。 注意:miRNA Reagent A溶液中含有胍盐,其具有烈的腐蚀性,试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施,如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗,再另行就医。 自备试剂: 异丙醇、乙醇、75%异丙醇 操作方法: 向1.5mL EP管中加入300μL miRNA Reagent A。将150μL抗凝全血加入到上述300μL miRNA Reagent A中,立即手腕用力震荡混合均匀。室温静置5分钟以充分裂解细胞。 向上述裂解完毕的裂解液中加入250μL miRNA Reagent B,上下颠倒混合均匀。13000rpm离心5分钟,吸取550μL上清液,转移到新的1.5mL EP管中。 向上述溶液中加入200μL无水乙醇,手腕用力震荡数次,室温放置5分钟。 13000rpm离心10分钟,转移700μL上清液到新的1.5mlEP管中。 向上述溶液中加入300μL异丙醇,手腕用力上下颠倒数次。 分两次将上述溶液倒入到miRNA吸附柱中,13000rpm离心1分钟,倒掉过滤液。 向吸附柱中加入700μL 75%异丙醇洗涤一次,13000rpm离心1分钟,倒掉过滤液。 向吸附柱中加入500μL无水乙醇洗涤一次,13000rpm离心1分钟,倒掉过滤液。 吸附柱13000rpm空离心2分钟,去掉残留的乙醇。 将吸附柱放入到新1.5mL EP管中,室温放置2分钟,使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μL RNase-Free TE Buffer,室温静置2分钟,13000rpm离心2分钟,洗脱产物即为提取的miRNA。 |
| 中文名称 | 英文名称 | 产品规格 | 货号 |
| 全血microRNA提取试剂盒 | miR-Quant microRNA Extraction Kit From Blood | 25T|100T | GOY-F9603 |
使用方法:
注意:标本采集人员需按有关规定做好个人防护。咽、鼻拭子好在发病的3天采集。
在安全柜内将本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5mL旋盖塑料管里(一容器)。
鼻拭子的采集:将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入上步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
咽拭子的采集:用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,将棉签浸入步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
直接在一容器上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、患者姓名。
将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封;每袋装一份标本。同时也将标本有关信息填在标本送检表上,连同一容器封于塑料袋内。
将装标本的密封袋放入自备的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器(二容器)内,拧紧盖,在容器上标明有关信息。同一患者2份以上的密封标本,可以放在同一个二容器内。二容器要承受不少于95 KPa的压力,内衬具吸水和缓冲能力的物质。所有容器必须印有生物危险标注。
将二容器摆放在用运输箱内(或疫苗运输箱),放入冰排,然后以柔软物质填充,并密封,由人(2人)运送,不得邮寄,好使用车。
采集的标本若不能在24小时内送达,则应尽快在⁻⁷0℃以下保存。无⁻⁷0℃条件的,需在4℃冰箱短时间暂存,并尽快联系递送标本。流感病毒在-20℃~-40℃时不稳定,故长期保存好在⁻⁷0℃温度以下进行。
操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
产品特点:
低温非冻型保存,不破坏病毒的外壳,方便长途运输。
适用于各种拭子样品,包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子等。
可以用于H1N1流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。
可以用柱式病毒DNA提取试剂盒或柱式病毒RNA提取试剂盒提取病毒核酸。
试剂本身安全环保无毒。
储存条件:常温,有效期一年。
可溶性凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(sLOX-1)酶联免疫试剂盒亚硝酸 CP,95%5-基吲哚 99%硬脂酸红霉素
全血microRNA提取试剂盒O-Benzyl-L-serine
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