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公司新闻
流式胞内染色中最常用的活化方法
点击次数：1823发布时间：2019/7/1 16:21:31
流式实验应用中，除了常见的表面抗原染色，还会进行胞内因子检测，比如：常见的细胞因子：IFN、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF；核内转录因子：FOXP3、GATA3、STAT5；胞内信号通路相关蛋白：MAPK家族 (AKT、P38、JNK、ERK) 等。胞内染色步骤相对复杂，涉及的变异因素多，很容易出现结果不稳定、较难重复等问题。
一般情况下，静息状态的T、B细胞不产生或极低产生细胞因子，多数细胞因子必须在T细胞激活后才能分泌产生，所以必须采用体外激活来刺激细胞因子的表达。流式胞内染色中最常用的活化方法就是使用一定浓度的广泛性刺激剂：PMA (佛波酯) 和lonomycin (离子霉素)，刺激细胞4-6 h (可优化)。
PMA和lonomycin刺激细胞活化的机制：在细胞内，Protein kinase C(PKC) 的激活，可以引起下游众多蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致多种蛋白的表达引起细胞的活化。PKC可以在DAG (二酯酰甘油) 和Calcium (Ca2+) 的共同作用下被激活，PMA是一种DAG的模拟物，lonomycin 是Ca2+的转运剂，可将细胞器内的Ca2+ 转运到胞浆，所以PMA和lonomycin的共同作用可以激活PKC，从而引起一系列的下游反应。
刺激后的细胞不能直接进行流式检测，细胞因子会分泌到胞外影响实验结果，还需要加入阻断剂，将细胞因子阻断在胞内，有助于细胞因子的聚集使胞内染色信号增强，提高检出率，所以这一步至关重要。常用的阻断剂有两种：1. Monensin (莫能霉素)；2. Brefeldin A (BFA，布雷非德菌素a)。
Monensin是一种离子载体(ionophore)，可选择性结合单价阳离子如：Li+、Na+、K+、Rb+、Ag+和Tl+，并把这些阳离子转运到细胞膜内，破坏跨膜离子梯度；BFA是一种真菌代谢物，可以干扰囊泡自粗面内质网至高尔基体的转运。这两种阻断剂的区别：Monensin的阻断作用在高尔基体转运到胞外，BFA的阻断作用在内质网转运到高尔基体。
