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公司新闻
流式细胞实验设计都需要设置哪些对照
点击次数：2911发布时间：2018/12/21 10:51:19
虽然介绍流式细胞术的入门文章很多，很多同学也对流式细胞术耳濡目染已久，看师兄师姐做过无数，可真到自己做的时候却又总出问题。据毛老师多年观察，很多同学在实验设计的时候就埋下了隐患，zui常见的问题就是对照设置不合理，zui后导致整体实验失败或数据不理想。因此，今天我们来谈谈成功的流式细胞实验设计都需要设置哪些对照。
毫不夸张地说，设置合理的对照组是整个实验成功的关键；反过来说，如果你掌握了流式实验如何设置对照的精髓，对整个免疫学相关的实验设计都会有极大地帮助。
流式对照至少有 5 种：生物学对照，空白对照，同型对照（Isotype control），补偿对照（也叫单阳性对照）和 FMO 对照，主要目的是为了避免出现的假阳性或假阴性结果。下面我们以一个具体的凋亡实验来看看如何设置对照组。下图是 Annexin V/PI 检测凋亡的原理示意图。
比如有两组细胞，一组给予药物处理（Treat 组），一组给予 DMSO 溶剂（Vehicle 组），拟用 Annexin V/PI 检测凋亡，我们来看看都需要设置哪些对照。
1、生物学对照
这个很容易理解，也是很多同学zui早设立的对照。这里 Vehicle 组就是生物学对照组。可能很多同学想象力就局限于此了，有了生物学对照就够了呗，还需要额外对照吗？答案是肯定的，别忘了流式细胞术也是一种免疫学实验，下面我们继续来设置对照。
2、空白对照
在流式上机检测前，我们还需准备额外一组细胞（正常或处理过的皆可），什么染料也不加，作为空白对照。为什么要设置空白对照呢？除了阳性荧光信号之外，我们还需要排除样本是否自带荧光背景，所以要用空白对照来验证在各个检测通道上的信号是否都是阴性。
3、同型对照（Isotype control）
这个对照很多同学都比较陌生。这个还得从抗体结构说起。大家知道抗体是个 Y 字形的，Fab 区域是特异性识别抗原的。在做蛋白免疫印迹时，只需考虑 Fab 的特异性就可以了，但是细胞的话稍微有点不同，因为有些细胞，特别是免疫细胞（B 细胞，T 细胞，巨噬细胞等等），它们表面有 Fc 受体，所以这个同型对照是为了评估抗体 Fc 段与靶细胞的结合情况。
所以在做免疫细胞的流式检测时，我们通常都需要加入 Fc 受体封闭剂，之后再加入目标抗体的 isotype 作为同型对照，来排除细胞 Fc 受体造成的假阳性结果。一般试剂商都会告知该抗体需要使用哪种同型抗体。
