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公司新闻
分享凝结芽孢杆菌特性测定
点击次数：1155发布时间：2018/3/19 10:10:11
将初筛得到的菌株进行液体培养，取菌液 1 μL接种于TYG固体平板，50 °C 培养，待菌落长出后倒入混有肠道致病菌的软琼脂，37 °C 培养观察平板上菌落生长情况，筛选抑菌能力较强的菌株用于后续实验。
取泡菜样品10 g放入装有90 mL无菌水并有小玻璃珠的 250 mL 三角瓶中，振荡 10 min 使之摇匀。将样品悬液置于 65 °C 水浴处理 10 min 后，吸取 2 mL 接种于可溶性淀粉培养基，50 °C、200 r/min 培养 36 h。取培养后的菌液 1 mL 进行 10 倍梯度稀释，取适宜稀释梯度涂布溴甲酚紫葡萄糖固体平板，50 °C 培养 48 h。待菌落长出后，挑取有黄色昏圈的菌落，分离纯化，编号保存。
设计凝结芽孢杆菌的特异性引物 P1 和 P2 (表 1)进行 PCR 扩增。PCR 反应体系：10×Buffer (含 MgCl2) 2 L，dNTPs (2.5 mmol/L) 1 L，引物 P1 和 P2 (10 mol/L)各 1 L，Taq DNA Polymerase (5 U/L) 0.1 L，DNA 模板 1 L，ddH2O 13.9 L。 PCR 反应条件：95 °C 5 min；95 °C 30 s，48 °C 30 s，72 °C 2 min，30 个循环。
若特异性引物能扩增出特异性条带，再用 16S rRNA 基因的通用引物 P3 和 P4 (表 1)扩增其基因片段(PCR反应条件同上)，将PCR 产物回收纯化，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测得的序列与 GenBank 中 16S rRNA 基因序列进行 BLAST 分析比对，以 16S rRNA 基因序列一致性≥99%为鉴定标准。
菌种活化后按 3%接种量转接 50 mL 液体 TYG 培养基，50 °C、200 r/min 培养至大部分菌体形成芽孢后，4 °C、6 500 r/min 离心 15 min 去上清液。收集芽孢加入无菌人工胃液，人工胃液 pH 值梯度为 1.5、2.5 和 3.5，37 °C 处理 2 h，于不同时间取处理液进行活菌计数。
准备人工肠液，其中分别加有 0.1%、0.3%、 0.5%、1.0%、2.0%和3.0%的胆盐。取1 mL菌株培养液，加入 9 mL 不同胆盐浓度的培养液中，37 °C 静置培养 6 h 后取培养液进行活菌计数。
活化好的菌液 0.1 mL 接种 TYG 固体平板上，放入常用抗生素药敏纸片，37 °C 培养观察菌落生长情况。安全性评价采用急性毒性试验，参照 GB15193.9-2014 最大耐受剂量法进行。取体重 18−22 g 的小鼠 15 只观察 3 d 后，1 日内分 3 次经口给予 0.25 g/mL 注菌液 0.4 mL (相当于每千克体重 15 000 mg)，连续 14 d 观察小鼠是否有中毒和死亡现象。
用 2 mL 无菌水将 TGY 试管斜面上的凝结芽孢杆菌菌苔全部洗下，接入到 TGY 液体培养基中， 50 °C 培养 24−48 h，镜检以芽孢为主即为成熟。在碳源基础培养基中分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、玉米淀粉各 5.0 g/L，进行碳源的单因素选择试验；在氮源基础培养基中分别加入酵母浸出粉、蛋白胨、黄豆饼粉、酵母膏、氯化铵、硫酸铵各 5.0 g/L 进行氮源单因素选择试验；在无机盐基础培养基中分别加入锰离子(硫酸锰)配置成如下浓度：0、5、10、15、20、30 mg/L，考察单因素锰离子浓度对芽孢生成的影响。
实验条件为：装液量50 mL (250 mL三角瓶)， 50 °C、200 r/min 摇瓶发酵 48 h，培养结束后分别测定活菌数及芽孢数，计算产孢率。实验中取活菌数及芽孢数较高的营养成分进行正交试验，确定最佳碳源及氮源。
在最佳培养基条件下，对接种量、培养时间、初始 pH 值及温度 4 个培养条件进行 5 水平的单因素试验(表2)。进行单因素试验时，4个因素的基本水平：接种量 3%，培养时间 48 h，初始 pH 7.0，培养温度 45 °C，即当进行接种量单因素试验时，培养时间、初始 pH 和温度固定，为基本水平。其他单因素试验同理。
1g 61270-78-8 头孢尼西钠标准品
1g 7681-49-4 氟化钠标准品
1g 7783-28-0 磷酸氢二铵标准品
1g 84696-11-7 紫锥菊粉末提取物标准品
1g 90028-20-9 狭叶紫锥菊提取物标准品
1g 9004-34-6 微晶纤维素标准品
1g 97281-15-7 苍白松果菊标准品
1g 硅化微晶纤维素标准品
1g 番茄提取物含番茄红素标准品
1ml Sevoflurane 28523-86-6 七氟烷标准品
1ml Propylene Glycol 57-55-6 丙二醇标准品
