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公司新闻
污染微生物的分离实验
点击次数：1191发布时间：2018/1/19 10:20:31
样本的预处理：超净工作台无菌取样到已灭菌的具盖 15 mL 离心管中，1 600×g 离心 4 min 除去大量链霉菌菌体，上清液于 4 °C 保存。取上清液进行简单显微镜观察，判定样本中污染微生物的基本形态及种类，同时测定各样本中 ε-PL 的含量及 pH 值。
污染微生物的分离：分别取 1 mL 4 °C 保存的上清液到 LB 液体培养基中进行富集培养，于 30 °C、200 r/min 培养。分别于 24、72 h 取富集培养液，10 倍稀释法稀释后取样涂布至牛肉膏蛋白胨及 LB 培养基上，3 个平行。同时分别取 4 °C 保存的上清液 10 倍稀释法稀释涂布在贝纳特、牛肉膏蛋白胨、LB 培养基上，37 °C 培养 48 h 观察菌落特征，并采用平板划线法进行纯化。
分类鉴定： 根 据 “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology” (9th edition)细菌分类标准，借助光学显微镜、扫描电镜等对分离菌株的营养细胞进行观察，扫描电镜样品的预处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程：(1) 用无水乙醇进行清洗，之后用 3%戊二醛溶液固定，再用四氧化二锇固定。(2) 干燥除去乙醇，减少表面张力对样品表面的影响。(3) 酒精梯度脱水之后，再用磷酸异戊酯过渡，干燥后用扫描电子显微镜观察。根据上述观察的形态特征，结合 16S rRNA 基因对分离得到的菌株进行鉴定。
分子鉴定：采用细菌基因组提取试剂盒抽提菌株总 DNA；用细菌通用引物 27F 和 1492R 对菌株总 DNA 进行 16S rRNA 基因扩增。PCR 反应使用 50 μL 体系：1 ng DNA 模板 3 μL，10×PCR mix 25 μL，5 U/μL Taq DNA 酶 0.5 μL，上下游引物 2 μmol/L 各 0.5 μL，ddH2O 20 μL 。PCR 程序为： 95 °C 10 min；94 °C 30 s，54 °C 30 s，72 °C 105 s，共 29 个循环；72 °C 10 min。PCR 结束后经琼脂糖凝胶电泳检测，符合测序要求后将 16S rRNA 基因片段送上海生工生物技术公司进行测序。利用 NCBI 中 BLAST 在线比对所测菌株的 16S rRNA 基因序列，将其与从 GenBank 数据库中获得的其他亲缘关系相近种属的 16S rRNA 基因，采用 ClustalX 2.0 软件进行多序列匹配排列(Multiple alignments)，用系统发生推断软件包 MEGA 6.0 进行系统发育分析。在 Kimura-2-parameter 模型的基础上，用 Neighbor-Joining (N-J)法构建分子系统树，自举分析 (Bootstrap) 1 000 次重复检测分子系统树的置信度，缺失和不确定的位点在计算中被省略。
分离菌株的验证：将分离菌株与 Streptomyces sp. M-Z18 按照摇瓶发酵工艺进行共培养，72 h 后平板划线培养观察菌落特征；将分离菌株于 M3G 培养基中培养 24 h 后分别接种 3 mL 到不同 pH 的 RSM 培养基中培养，考察其 pH 耐受性，培养 72 h 后 620 nm 下测定 OD。发酵污染一般在发酵中后期，此时发酵 pH 控制在 3.8，ε-PL 产量在 20 g/L 以上。为进一步验证分离菌株的聚赖氨酸耐受性，将其于 M3G 培养基中培养 24 h，取 3 mL 接种至分别含 12、24、36、48 g/L ε-PL pH 3.8 的 RSM 培养基中培养 72 h，再用培养液直接点接种平板观察是否有菌落生长。
Stevioside HPLC≥95% 甜菊苷 20mg/支
Gastrodin HPLC≥98% 天麻素 20mg/支
Ursolic acid HPLC≥98% 熊果酸 20mg/支
Arbutin HPLC≥98% 熊果苷 20mg/支
Synephrine HPLC≥98% 辛弗林 20mg/支
Coumarin HPLC≥98% 香豆素 20mg/支
p-Coumaric acid HPLC≥98% 对香豆酸 20mg/支
Tetrahydropalmatine 滴定法≥98% 延胡索乙素 20mg/支
