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病毒性出血性败血症病毒（VHSV）荧光 RT-PCR 检测试剂盒说明书
点击次数： 142发布时间：2018/1/23 10:36:25
- 上 传 者： 上海谷研实业有限公司
- 上传时间： 2018/1/23 10:36:25
- 文件大小： 33KB
- 文件类型： jpg
- 所属分类： 其它资料
- 下载次数： 279次
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资料简介： 1、 试剂盒简介
货号：HB-703-1
病毒性出血性败血症，是病毒性出血性败血症病毒（VHSV）感染所产生的一种弹状病毒性疾病，
该病毒易感宿主种类，包括很多海水和淡水养殖鱼类。易感鱼群各鱼龄阶段均可感染，鱼龄越小越
易发病死亡，亲鱼较少发病。该病传染性极强，能在一年四季流行，但是，通常发生于春季水温上
升或者波动时，易感动物主要为虹鳟、大菱鲆、日本牙鲆等。
为了适应病毒性出血性败血症病毒（VHSV）快速检测和疫病研究的需要，本公司参考 2015 年
OIE 水生动物疾病诊断手册 2.3.9 中规定的引物和探针序列，经多次实验及系统优化，开发生产了
本试剂盒。应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通
量检测等特点及优点。
2、 试剂盒组成
试剂盒组成包括核酸扩增试剂。具体组成参见表 1：
表 1：试剂盒组成（50test/盒）
试剂盒组成成分 体积
核酸提取试剂： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸扩增试剂： DEPC 水
VHSV 荧光 RT-PCR 反应液
酶混合物
阴性对照
VHSV 荧光阳性对照
1ml×1 管
750µL×1 管
60µL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：核酸提取试剂可使用本公司生产的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取试剂盒》）
3、 样本采集,存放及运输
3.1 样本采集：所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。
取新鲜鱼类组织脏器（肝、脑、脾、肾）2g 于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加 5ml PBS
混匀，2 000r/min 离心 10min 取上清转入无菌离心管中备用。或取有可疑细胞病变的细胞悬液用于检测。
3.2 存放：研磨后的样本在 2 ℃—8 ℃条件下保存应不超过 24 h；-70 ℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融 3 次）。
3.3 运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。
4、 荧光 RT-PCR 检测
4.1 操作方法
4.1.1 样本的处理（在样本制备区进行）：
4.1.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性
对照、阴性对照在试剂盒中已标出），做标记。
4.1.1.2 每管加入 600 µL 裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各 200 µL，一份样本
换用一个吸头，再加入 200 µL 氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，
也可以用手颠倒混匀），于 4℃ 12 000 r/min 离心 15 min。
4.1.1.3 取与 4.1.1.1 相同数量灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 µL 异丙醇（-20℃预冷），
做标记。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取 500µL，不能吸
出中间层，颠倒混匀。
4.1.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入 600 µL 75％
乙醇，颠倒洗涤。
4.1.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。
4.1.1.6 4 000 r/min 离心 10s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余
液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要
碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.1.7 加入 11 µL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备
用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。
【也可参照《病毒 RNA 柱式提取试剂盒说明书》（货号：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。
4.1.2 检测
4.1.2.1 扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出相应的荧光 RT-PCR 反应液、酶混合物，在室温下融化后，2000 r/min 离心 5 s。设所需荧光 RT-PCR 检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见表 2：
表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 RT-PCR 反应液 酶混合物
用量 15 μL 1.0 μL
根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装16 µL，转移至样本处理区。
4.1.2.2 加样（样本处理区进行）：
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤4.1.1.7中制备的RNA溶液各10 µL，盖紧管盖，500 r/min离心30 s。
4.1.2.3 荧光 RT-PCR 检测（在检测区进行）：
将4.1.2.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：
第一阶段，反转录50 oC /30 min；
第二阶段，预变性95 o
C/15 min；
第三阶段，94 o
C/15s，60 o
C/40s，72 o
C/20s，40个循环，在第三阶段每次循环的60 o
C退火延
伸时收集荧光。
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
4.2 结果判定
4.2.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
4.2.2 质控标准
4.2.2.1 阴性对照无 Ct 值或无扩增曲线。
4.2.2.2 阳性对照的 Ct 值应<28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
4.2.3 结果描述及判定
4.2.3.1 阴性
无Ct值或无扩增曲线，示样品中无VHSV核酸。
4.2.3.2 阳性
Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在VHSV核酸。
4.2.3.3 有效原则
Ct值>30的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
5、 相关技术信息（引物和探针序列）
Forward primer: 5’-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3’,
Reverse primer: 5’-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3’,
and probe: 5’-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTGATC-TTC-TG-BHQ1.
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