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技术文章
猪 RANTES/CCL5 qPCR 实验全流程指南
点击次数：743 发布时间：2026/6/24 11:24:44
以下是猪RANTES/CCL5 qPCR实验的全流程指南，覆盖从样本准备到数据分析的完整步骤，结合猪物种特性及qPCR通用规范，确保实验可重复性和结果准确性：
一、实验前准备
1. 材料与试剂
样本：猪T细胞（原代培养或细胞系，纯度≥90%，CD3⁺标记验证）；
试剂：
猪RANTES/CCL5特异性qPCR引物（正向：ATG GCT GCA GAA GAG GAA GA，反向：TCA GGT GGA GGG TCA GAA GA，退火温度58℃）；
内参基因引物（推荐猪GAPDH：正向GGA GGT GGA GGG TCA GAA GA，反向GCT GGA GGG TCA GAA GA GCT，退火温度60℃）；
RNA提取试剂盒（如Trizol法或柱式法，需适配猪细胞）；
反转录试剂盒（如M-MLV逆转录酶，含RNase抑制剂）；
qPCR预混液（SYBR Green法，含ROX染料需匹配仪器要求）；
无核酸酶水、DNase I（去除基因组DNA）。
仪器：
低温离心机、-80℃冰箱、PCR仪（支持SYBR Green荧光检测）、实时荧光定量PCR仪（如Bio-Rad CFX96、Thermo QuantStudio）；
超净工作台、移液器（校准过，精度±1%）。
2. 实验分组设计
对照组：未加调控因子的T细胞；
实验组：添加候选调控因子（如IFN-γ 100U/mL、IL-10 10ng/mL）；
抑制剂组：添加信号通路抑制剂（如NF-κB抑制剂BAY 11-7082）；
空白组：无细胞模板（仅加无核酸酶水）。
二、实验步骤
（一）RNA提取（关键步骤，避免降解）
细胞裂解：
收集对数生长期的猪T细胞（1×10⁶个/管），加入Trizol试剂（1mL/10⁷细胞），充分吹打裂解；
或采用柱式法：按试剂盒说明书，加入裂解液裂解细胞，结合磁珠/硅胶柱纯化RNA。
RNA纯化：
Trizol法：加入（0.2mL/1mL Trizol），剧烈振荡15秒，静置3分钟，4℃、12000rpm离心15分钟，取上层水相；加入异丙醇（0.5mL/1mL水相），室温静置10分钟，离心沉淀RNA；用75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀，晾干后溶于DEPC水。
柱式法：按说明书加样、洗涤、洗脱，直接获得无DNA污染的RNA。
质量检测：
用NanoDrop检测RNA浓度（A260/A280比值1.8-2.0为合格）和纯度；
用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性（28S/18S rRNA比值≈2，无拖尾）。
（二）反转录合成cDNA
反应体系（20μL）：
总RNA：1μg（OD260=1的RNA，1μL≈40μg/μL）；
反转录缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂、M-MLV逆转录酶：按试剂盒说明书；
无核酸酶水：补足至20μL。
反应条件：
42℃ 60分钟（反转录）；
70℃ 15分钟（灭活逆转录酶）。
cDNA保存：-20℃保存，避免反复冻融。
（三）qPCR扩增与检测
反应体系（20μL，SYBR Green法）：
2×qPCR预混液：10μL；
猪RANTES/CCL5引物（10μM）：0.8μL（终浓度400nM）；
猪GAPDH引物（10μM）：0.8μL（终浓度400nM，内参）；
cDNA模板：2μL（相当于10ng总RNA）；
无核酸酶水：6.4μL。
反应程序：
预变性：95℃ 30秒；
循环：95℃ 5秒（变性）→ 60℃ 34秒（退火/延伸），重复40个循环；
熔解曲线：60℃→95℃，升温速率0.5℃/秒，采集荧光（验证产物特异性，单峰为合格）。
上机检测：
每孔加样后，密封板盖，放入实时荧光定量PCR仪；
设置对照组、实验组、空白组，每个样本设3个复孔。
（四）数据分析
Ct值提取：
从qPCR原始数据中提取RANTES/CCL5和GAPDH的Ct值（荧光信号超过阈值时的循环数）。
相对定量计算（2⁻ΔΔCt法）：
计算ΔCt = Ct（RANTES/CCL5） - Ct（GAPDH）；
计算ΔΔCt = ΔCt（实验组） - ΔCt（对照组）；
相对表达量 = 2⁻ΔΔCt（对照组设为1.0）。
统计验证：
用GraphPad Prism或SPSS进行t检验（两组）或ANOVA（多组），p<0.05为差异显著。
三、关键注意事项
物种特异性：所有引物、试剂需标注“猪源”，避免人/鼠交叉反应；
基因组DNA去除：RNA提取后需用DNase I处理，或设计跨内含子引物，避免假阳性；
RNA质量：降解的RNA会导致Ct值异常升高，需严格检测RNA完整性；
复孔设置：每个样本至少3个复孔，减少操作误差；
内参选择：猪GAPDH、β-actin为稳定内参，需验证实验条件下内参表达无差异。
原创作者：上海谷研实业有限公司
