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技术文章
抗纤维细胞生长因子结合蛋白抗体提样品制备
点击次数：3736 发布时间：2020/1/15 15:44:43
抗纤维细胞生长因子结合蛋白抗体提样品制备
1、 将培养液吸入至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。
2、 弃上清，加入5 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
3、 用枪吸干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4、将裂解液4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml EP管中并置于-20℃保存。
5、BCA法测蛋白浓度
SDS－PAGE电泳
1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）
3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、 按方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入孔槽。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5、 用水冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽中。
6、 测完蛋白含量后，计算含20-50 μg蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200 μl的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。上样前要将样品于沸水中煮5-10 min使蛋白变性。
7、 加入足够的电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品（包括一孔做可视的蛋白marker）。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）
8、电泳：浓缩胶时用80-100 V跑，到分离胶以后用150-200 V跑，总时间2 h左右，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
原创作者：上海谷研实业有限公司
