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猪伪狂犬病毒gE基因荧光PCR检测试剂盒
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详细内容
通用名称:猪伪狂犬病毒gE基因荧光PCR检测试剂盒(实时荧光PCR法)
英文名称:Porcine Pseudorabies/ virus gE gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
包装规格:50T/盒
预期用途:
猪伪狂犬/病毒在分类学上属疱疹病毒科猪疱疹病毒属。本试剂盒利用实时荧光PCR原理,定性检测PPRV gE,对PRV引起的猪的疫病的诊断和监控具有重要指导意义。
猪伪狂犬/病毒(gE)检测试剂盒原理
本试剂盒针对PPRV gE高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含PPRV gE基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

【使用方法】
一、试剂准备(在试剂准备区进行)
1. 取出包装盒中的各组分,室温放置,待其完全融化,混匀后备用。
2. 根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量,按下表1单反应体系配制方法,取相应量的试剂,充分混匀成PCR-Mix,按照20 μL/反应分装到PCR反应管中,瞬时离心后备用。
表1:单反应体系配制方法
| 试剂 | 反应液 | 混合酶 |
| 用量 | 19 μL | 1 μL |
二、样本准备(在样本准备区进行)
1. 使用商品化的病毒核酸提取试剂盒,参照说明书进行操作,提取好的核酸样本如不能立即检测,建议⁻⁷0℃以下保存。
2. 取出样本后混匀,将阴性对照、待测样本、阳性对照各5 μL加入到PCR反应管中混匀。
3. 盖上管盖,2000 rpm离心30。
4. 将PCR反应管转移到扩增区进行上机。
三、PCR(在核酸扩增区进行)
1. 将上述PCR反应管按照实验布局依次放入PCR仪对应检测孔内,并记录顺序。
2. 按表2设置PCR扩增循环参数。
表2:PCR扩增相关参数
| 体系 | 反应体系设为25 μL | ||
| 信号采集 | 选择FAM通道检测H5亚型; 选择CY5通道检测H7亚型; 选择ROX通道检测H9亚型。 | ||
| PCR 反应 条件 | 阶段 | 条件 | 循环数 |
| 逆转录 | 50℃:30 min | 1 | |
| 预变性 | 95℃:5 min | 1 | |
| PCR | 95℃:15 sec | 45 | |
| 60℃:30 sec (此阶段结束时采集荧光信号) | |||
【结果分析】
表3:结果分析表
| 实验成立 条件 | 阴性对照 | 三通道Ct>38或者No Ct,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。 |
| 阳性对照 | 三通道Ct≤30且出现典型的S型扩增曲线。 | |
| 样本结果 判定标准 | H5亚型 阳性 | FAM通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。 |
| H7亚型 阳性 | CY5通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。 | |
| H9亚型 阳性 | ROX通道Ct≤35且出现典型的S型扩增曲线。 |
| 结果可疑 | 任一通道35<Ct≤38,建议复测,复测结果仍为可疑,且出现明显指数增长,判为阳性。否则为阴性。 |
| 结果阴性 | Ct>38或者No Ct,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。 |
【注意事项】
1. 使用本试剂盒的实验室,应严格按照国家有关基因扩增检验实验室管理规范进行管理。
2. 各区域物品均为用,不得交叉使用,以免污染。检测结束后,应立即对工作台进行清洁消毒。
3. 吸取反应液时,应尽量避免产生气泡。上机,应注意检查各反应管是否盖紧,以免液体蒸发造成结果不准确。
4. 检测过程中使用过的吸头,应直接打到盛有10%次氯酸的废液缸内,检测结束的PCR反应管,切忌开盖,并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
5. 工作台及各种实验用品应定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外灯进行消毒。
6. 试剂使用应在常温下充分融化并混匀。不同批号的试剂请勿混用,并在有效期内使用。
【储存条件与有效期】
试剂盒应置于-20℃冷冻避光贮存;
试剂盒保存有效期为12个月;
试剂盒反复冻融次数不宜超过5次。
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