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人凝血因子Ⅸ(FⅨ)ELISA试剂盒应用方法
点击次数： 53发布时间：2025/5/29 10:50:27
- 上 传 者： 上海岑特生物科技有限公司
- 上传时间： 2025/5/29 10:50:27
- 文件大小： 36KB
- 文件类型： docx
- 所属分类： 应用方法
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资料简介： 人凝血因子Ⅸ(FⅨ)ELISA试剂盒 检测原理
试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人凝血因子Ⅸ（FⅨ）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人凝血因子Ⅸ（FⅨ）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
操作注意事项
1.试剂盒保存在2-8℃，使用室温平衡60分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解后再使用。样本在使用也要在室温平衡60分钟。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.预处理后的样本无需稀释，直接取10μL加样即可。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用充分摇匀。
试剂组成
名称 96孔配置 48孔配置 备注
微孔酶标板 12孔×8条 12孔×4条 无
标准品 0.3mL 0.3mL 无
样本.稀释液 6mL 3mL 无
检测抗体-HRP 10mL 5mL 无
20×洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释
底物A 6mL 3mL 无
底物B 6mL 3mL 无
终止液 6mL 3mL 无
封板膜 2张 2张 无
说明书 1份 1份 无
自封袋 1个 1个 无
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
1.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2.自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步骤
1.从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀.释液40μL；
4.随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能
1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2.灵敏度：.低检测浓度小于0.1 ng/mL。
3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内变异系数小于10%、板间变异系数小于15%。
5.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6个月
免责声明
1.试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。
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