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人谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)ELISA试剂盒使用说明书
点击次数： 43发布时间：2024/5/11 11:17:34
- 上 传 者： 上海岑特生物科技有限公司
- 上传时间： 2024/5/11 11:17:34
- 文件大小： 39KB
- 文件类型： docx
- 所属分类： 操作维修手册
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资料简介： 【实验原理】 本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人GSH-Px抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人GSH-Px会与包被抗体结合。依次加入生物素化的抗人GSH-Px抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人GSH-Px抗体与结合在包被抗体上的人GSH-Px结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，GSH-Px浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中GSH-Px的浓度。 【样本处理及要求】 1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。 4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。 5.其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。 6.样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。 7.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。 8.如果您的样品中检测物浓度高于标准品高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍数）。 样品稀释指导： 用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的佳检测范围。 为避免样本中基质效应的影响，建议样本少稀释一倍。 以上方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。 注：标本溶血会影响后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 【注意事项】 1．为确保试验结果的有效性，建议先做预实验，以确定适当的稀释倍数。 2．酶标板袋拆封后，尽快将不用的板孔放回，并放入干燥剂，保持酶标板干燥。 3．用户在初次使用试剂盒时，应将试剂盒平衡至室温，各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。 4，TMB避光保存。 5，洗板过程非常重要，不充分的洗板易导致假阳性。 6．建议所有标准品、样本都做双份检测。 7．请保持试验过程的连续性，禁止酶标板干燥，因干燥会使酶标板上的生物成分迅速失活。 8．为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。 9．禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。 【检测步骤概要】 1) 准备所有的试剂和梯度稀释的标准品。板条加入300 μl 1×洗液静置浸泡30 。 2) 标准品孔加入 100 μl 2 倍倍比稀释的标准品。空白孔加入 100 μl 标准品稀释液(血清/血浆样本)或培养基(细胞培养上清样本)。 3) 血清/血浆：样本孔加入 90 μl 1×检测缓冲液和 10 μl 样本。细胞培养上清：样本孔加入 100 μl 细胞培养上清。 4) 每孔加入 50 μl 1:100 稀释的检测抗体。步骤 2、3、4 在 15 分钟内完成。 5) 封膜，室温孵育 1.5 小时。 6) 洗涤 6 次。 7) 每孔加入 100 μl 1:100 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。 8) 封膜，室温孵育 30 分钟。 9) 洗涤 6 次。 10) 每孔加入 100 μl 显色底物，避光，室温孵育 5 - 30 分钟。 11) 每孔加入 100 μl 终止液。 12) 30 分钟内，在 450 nm 波长检测 OD 值，参考波长 570 nm 或 630 nm。 【结果判断】 1. 以标准品的浓度为横坐标， OD值为纵坐标， 绘制标准曲线。 如有设置复孔，则应取其平均值计算。 以标准品的浓度为横坐标， OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。 2. 推荐使用业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
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