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人Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)ELISA试剂盒使用说明书
点击次数： 50发布时间：2024/4/28 12:00:25
- 上 传 者： 上海岑特生物科技有限公司
- 上传时间： 2024/4/28 12:00:25
- 文件大小： 98KB
- 文件类型： docx
- 所属分类： 操作维修手册
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资料简介： 1. 实验原理：本试剂盒采用竞争法检测样本中人Ⅳ型胶原(COL4)的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。 2.试剂盒内容及其配制 3.试剂准备 a.使用所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。 b.本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。 c.洗涤液为25倍浓缩液，使用将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。 d.标准品的稀释：先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl，然后漩涡混匀30即为标准品原液（24小时内用完）。取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上160ng/L,80ng/L,40ng/L,20ng/L ,10ng/L .取150μl标准品原液加入标记160ng/L 的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至后一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。 e.生物素抗原的稀释：抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中，漩涡混匀15至冻干粉完全溶解，然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30即为生物素抗原工作液。 f.亲和素-HRP的稀释：低速离心（使浓缩液全部沉到管底），将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30即为亲和素-HRP工作液。 4.洗板方法 a.手工洗板：先洗去酶标孔中的的液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。 b.洗板机洗板：洗板机洗板比较便捷，但应操作熟练后使用。 5.性能参数： a.批内差：CV＜10% b.批间差：CV＜12% c.灵敏度：1ng/L d.保存： 2-8℃ e.规格： 96T/盒 f.有效期： 6个月（2-8℃）。 6.详细操作程序 a. 使用请先将试剂盒在室温下平衡半小时。 b. 空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。 c. 标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做，并将其作为标曲的后一个点)。 d. 样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。 e. 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。 f. 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。 g. 第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30后弃去，如此重复5次，拍干。 h. 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。 i. 第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30后弃去，如此重复5次，拍干。 j. 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。 k. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色). l. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。 m. 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线
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