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人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)ELISA试剂盒说明书
点击次数： 20发布时间：2024/1/2 14:48:47
- 上 传 者： 上海岑特生物科技有限公司
- 上传时间： 2024/1/2 14:48:47
- 文件大小： 19KB
- 文件类型： docx
- 所属分类： 操作维修手册
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资料简介： 人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)使用目的：
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)含量。
人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)水平。用纯化的人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)，再与HRP标记的黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)浓度。
试剂盒组成：
Reagent Quantity
酶标包被板 12well×8strips
标准品 1600pg/ml 1×0.5ml
标准品稀释液 1×1.5ml
酶标试剂 1×6ml
样品稀释液 1×6ml
显色剂A液 1×6ml
显色剂B液 1×6ml
终止液 1×6ml
30倍浓缩洗涤液 1×20ml×30flod
说明书 1
封板膜 2
密封袋 1
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4） ，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤：
1. 标准品：其浓度为1600pg/ml(贮液)。先将其稀释为1600pg/ml（标准曲线高浓度)后，再准备5个稀释标准品的EP 管，每个EP 管中加入150μL 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成1600pg/ml，800pg/ml，400pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml标准品稀释液（0pg/ml）直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液
Tube 0 1 2 3 4 5
pg/ml 1600pg/ml 800pg/ml 400pg/ml 200pg/ml 100pg/ml 50pg/ml
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μ l，然后再加待测样品 10μ l（样品终稀释度为 5 倍） 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
4. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 后弃去，如此重复 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μ l，空白孔除外。
7. 温育：操作同 3。
8. 洗涤：操作同 5。
9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μ l，再加入显色剂 B50μ l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15 分钟.
10. 终止：每孔加终止液 50μ l，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值） 。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。
注意事项：
1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4． 请每次测定的同时做标准曲线，好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD
值大于标准品孔第一孔的 OD 值） ，请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请后乘以总稀释倍数（×n×5） 。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物请避光保存。
7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9． 本试剂不同批号组分不得混用。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 以上。
2.批内与批见应分别小于 9%和 11%
3.保存条件及有效期：
a.试剂盒保存：2-8℃。
b.有效期：6 个月
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