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真菌基因组DNA提取试剂盒说明书
点击次数： 89发布时间：2022/2/21 13:02:15
- 上 传 者： 昆山远慕生物科技有限公司
- 上传时间： 2022/2/21 13:02:15
- 文件大小： 30KB
- 文件类型： docx
- 所属分类： 操作维修手册
- 下载次数： 5次
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资料简介： 真菌基因组DNA提取试剂盒说明书 产品简介：
货号：R2300
规格：50T/ 100T
保存：室温(15℃-25℃) 干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。
试剂盒内容：
50T 100T RNase A 1mL 1mL×2 蛋白酶K 1mL 1mL×2 玻璃珠 6g 11g 溶液A 10mL 20mL 溶液B 10mL 20mL 漂洗液 15mL 15mL×2 洗脱液 10mL 20mL 吸附柱 50个 100个 收集管 50个 100个 说明书 1份 1份
真菌是具有真核和细胞壁的异养生物，种属很多，已报道的属达1万以上，种超过10万个。真菌通常又分为三类，即酵母菌、霉菌和蕈菌（大型真菌）。对于酵母菌和霉菌，可以用玻璃珠处理，而对于大型真菌，可直接用液氮研磨。经过期处理的菌液，用硅质膜吸附，即可得到高纯度的基因组。提取纯化后的DNA，可以直接用于 PCR/Real time-PCR，sequencing，Southern blot，mutant analysis，SNP 等下游应用实验。
操作步骤：
使用请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、样品的处理：
1）对于酵母菌，取1-2mL培养好的菌液，离心收集，弃上清。加入200uL 溶液A，加入20uL RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5-10min。
2）霉菌(孢子也可相同处理)：取50-100mg菌丝，加200uL溶液A，用玻璃研磨器适当研磨分散菌丝，加入20uL RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约30min。
3）大型真菌（如蘑菇等）：称取50-100mg样品，倒入适量的液氮，立即研磨重复3 次，使样品研成粉末（如无液氮，可加200uL溶液A后用玻璃研磨器适当研磨），加200uL溶液A，加入20uL RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5min。
2、 加入20uL的蛋白酶K（10mg/mL），充分混匀，55℃水浴消化30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次。 12000rpm离心2min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。
3、在上清中加入200uL溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，请增加消化时间。
4、再加入200uL无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2分钟。
5、12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
6、向吸附柱中加入600uL漂洗液(使用请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入600uL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8、12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。
9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200uL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。
10、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。
注意事项：
1. 由于真菌种类万千，对于一些特别难处理的真菌，可用液氮研磨，再用玻璃珠振荡，蛋白酶K处理，一般都可以得到一定量的基因组DNA，如电泳检测很弱，一般PCR都会有较好结果。
2. 若溶液A或溶液B中有沉淀，可在55℃水浴中重新溶解。
3. 如果DNA提取量很少，可加长玻璃珠处理时间，如果提取DNA成弥散短条带，可减少玻璃珠处理时间。
4. 洗脱缓冲液的体积好不少于50uL，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
5. DNA浓度及纯度检测：得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50 μg/mL双链DNA、40 μg/mL单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
6. 在确保样品无误的情况下，如经过多次试验，都无法提出DNA，请将部分样品寄至我公司，我们代为摸索优化条件，以使您的实验能够正常进行下去。
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