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资料下载
Western及IP细胞裂解液使用说明书
点击次数： 107发布时间：2021/12/10 14:38:34
- 上 传 者： 上海古朵生物科技有限公司
- 上传时间： 2021/12/10 14:38:34
- 文件大小： 15KB
- 文件类型： docx
- 所属分类： 其它资料
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资料简介： 中文名称：Western及IP细胞裂解液 简介： 用Western及IP细胞裂解液得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。 操作步骤(仅供参考)： (二)悬浮培养细胞 (三)组织样本 注意事项：
分 类：蛋白提取
规 格：100ml
保存条件：—20℃,12个月
用 途：裂解细胞提取总蛋白质,主要用于Western,免疫沉淀,免疫共沉淀等
注意事项：主要由Tris 、NaCl、Triton X-100组成。含有一支1.5ml PMSF。
多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等。Western及IP细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100，低浓度sodium pyrophosphate等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
(一)贴壁培养细胞
1、 取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度。
2、 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗，低速离心，弃上清，留取沉淀。
3、 每孔加入含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。
4、 离心(如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳)，取上清。
5、 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
1、 取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
2、 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
3、 用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。通常6孔板每孔细胞加入裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、 离心 (如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、 进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀等操作。
1、 取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
2、 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
3、 取在液氮或超低温冰箱中冷冻以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制，以减少蛋白的降解。
4、 按照组织加入裂解液，加入含有PMSF的裂解液。裂解。
5、 步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入裂解液的比例加入含有PMSF的Western及IP细胞裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制，以减少蛋白的降解。
6、 按照每组织加入裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。
7、 离心 (如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
8、 进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
1、 去除贴壁细胞的培养液时，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
2、 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
3、 如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
4、 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
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