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资料下载
7型胶原抗体操作步骤
点击次数： 75发布时间：2021/6/24 15:50:33
- 上 传 者： 上海古朵生物科技有限公司
- 上传时间： 2021/6/24 15:50:33
- 文件大小： 19KB
- 文件类型： jpg
- 所属分类： 应用方法
- 下载次数： 3次
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资料简介： 【产品名称】：7型胶原抗体
【英文名】：Anti-Collagen VII
【规格】：0.1ml/0.2ml（更大包装可详询）
【浓度】：1mg/1ml
【抗体来源】：Mouse,Rabbit or Goat
【*类型】：polyclonal or monoclonal
【产品类型】：一抗
【性状】：Lyophilized or Liquid
【亚型】：IgG
【纯化方法】：affinity purified by Protein A
【储 存 液】：0.01M PBS, pH 7.4 with 10 mg/ml BSA ａnd 0.1% Sodium azide
【产品应用】：not yet tested in other applications.optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.
【保存条件】：Store at -20 °C for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles.
7型胶原抗体CollagenVII免疫标记，Western Blot抗体杂交：孵育一抗
A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。
B. 配好5%的Milk（TBST溶解），按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，采用梯度稀释。
C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。
注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小基质金属蛋白酶-1抗体MMP1免疫标记，免疫组化实验操作步骤（以石蜡切片为例）
仪器、设备：移液枪、免疫组化笔、水浴锅、计时器、孵育湿盒、切片架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。
操作步骤：
1.脱蜡水化。将石蜡切片置于新鲜二甲苯脱中浸泡 15 分钟，重复三次。去除多余的液体后，依次置于无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡 5 分钟，蒸馏水（或自来水）冲洗 5 分钟。用 PBS 缓冲液（试剂 1，将干粉溶解于 1L 去离子水中）冲洗切片 5 分钟，重复三次。
2.抗原修复。将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的耐高温塑料切片架上，加适量修复液 1× 柠檬酸钠抗原修复液（试剂 2，将 100×柠檬酸钠抗原修复液加去离子水稀释成 1×柠檬酸钠抗原修复液），液面要浸过切片组织一定高度，将修复盒置于沸水中煮沸修复 15 分钟后取出玻片，自然凉至室温。用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
注意：抗原修复时，修复液务必保证切片始终浸泡在液体内，一般情况：修复液的量约为 800mL/1 架。3.阻断内源性过氧化物酶。用吸水纸擦干玻片，免疫组化笔在组织周围画圈，滴加 50μL 内源性过氧化物酶阻断剂（试剂 3）到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育 30 分钟，用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
4.血清封闭。用吸水纸擦干玻片，滴加 50μL 正常山羊血清工作液（试剂 5），37℃封闭 20 分钟，以减少非
特异性染色。
5.一抗孵育。用抗体稀释液（试剂 4）将一抗原液稀释成工作液，用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，滴加适量抗体工作液，置于湿盒 4℃孵育过夜或 37℃孵育 1h-2h。
6.复温。4℃过夜后从冰箱拿出样本，在室温下孵育 15min 复温（抗体孵育为 4℃过夜选用此步骤，如室温孵育直接进入下一步清洗）。用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
7.二抗孵育。吸水纸擦干切片后滴加 50μL 生物素标记的羊抗兔 IgG（试剂 6），37℃孵育 20 分钟，用 PBS
缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
8.三抗孵育。吸水纸擦干切片后滴加 50μL 辣根酶标记的链酶卵白素孵育（试剂 7），37℃孵育 20 分钟，用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。
9.显色。甩去 PBS 缓冲液，吸水纸擦干切片； 每张切片滴加新鲜配制的 DAB 工作液 50μL（试剂 8：试剂 9：试剂 1=1:1:18 比例配置），孵育 3-5min，光学显微镜下观察染色结果，切勿显色过深；显色后用自来水冲洗切片终止显色。
10.复染。滴加适量苏木素染液（试剂 10）复染，孵育 1-5 分钟，自来水冲洗 5 分钟，滴加盐酸酒精分化
液分化 30 ，自来水冲洗。
11.脱水封片。将玻片依次置于 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇，各浸泡 5 分钟， 再将玻片放入二甲苯中浸泡 15 分钟，重复三次。玻片取出来稍晾干，用中性树胶封片。
结果判断：在光学显微镜下对染色的切片观察并判断。苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显色的阳性表达为棕黄色。
注意事项：
1.检测样本时需同时做阴性对照和阳性对照，否则结果不可取。
2.本品中的配套试剂，请不要用其他生产商产品替换使用。
3.DAB 为致癌物质，请采取必要的防范措施，现用现配。
4.本产品仅限于业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗。
5.此试剂是否可用于除中性福尔马林或多聚甲醛之外固定的组织未得到验证。
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