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技术文章
《细胞培养从入门到精通：实验人员必备操作指南》
点击次数：1501 发布时间：2025/12/23 9:53:54
一、细胞培养的核心目标
细胞培养的本质是在体外为细胞提供一个接近体内的生存环境，使其能够：
1. 存活：保持良好的生理状态。
2. 增殖：在可控条件下稳定生长。
3. 可重复实验：为后续实验（如药物处理、转染、蛋白表达等）提供可靠的细胞模型。
二、细胞培养的基本条件
1.温度与气体环境
-温度：哺乳动物细胞一般为37℃。
- CO₂：常用5% CO₂，用于维持培养基中碳酸氢盐缓冲体系的pH（约7.2–7.4）。
-湿度：培养箱内保持95%左右的湿度，防止培养基蒸发。
2.培养基与血清
基础培养基（如DMEM、RPMI-1640、MEM等）提供：
-氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等基础营养。
-酚红作为pH指示剂（黄色偏酸，紫色偏碱）。
完全培养基：基础培养基+血清+必要添加物。
血清的作用：
-提供生长因子（如EGF、FGF）。
-提供贴壁因子，帮助细胞贴附在培养器皿表面。
-提供载体蛋白（如白蛋白），运输激素、脂质等。
-缓冲环境变化，提高细胞的稳定性。
在选择血清时，通常关注：
-批次间稳定性。
-低内毒素、低溶血。
-无支原体等微生物污染。
三、无菌操作与生物安全柜
1.生物安全柜的使用要点
-操作前用75%乙醇擦拭台面。
-只放置当前实验必需的物品，保持台面整洁。
-所有操作尽量在安全柜的中层区域进行，避免频繁进出。
-打开瓶盖时，瓶口朝下倾斜，尽量缩短暴露时间。
-操作结束后再次用75%乙醇擦拭台面。
2.无菌操作原则
-动作要轻、慢、稳，减少空气扰动。
-避免在安全柜内剧烈晃动、讲话时正对操作台。
-所有接触细胞的液体和耗材必须是无菌的。
四、常用耗材与培养器皿
1.培养器皿
- T瓶：T25、T75、T175等，数字表示培养面积。
-多孔板：6、12、24、96孔板，用于不同规模的实验。
-离心管：15 mL、50 mL，用于细胞收集和重悬。
2.耗材要求
-无菌、无热原。
-贴壁细胞使用TC-treated（组织培养处理）的器皿，以利于细胞贴附。
五、日常操作流程
1.换液（Feeding）
目的：补充营养，清除代谢废物。
贴壁细胞：
1. 吸弃旧培养基（注意不要吸到细胞层）。
2. 加入预热的完全培养基。
悬浮细胞：
1. 将细胞悬液转移至离心管，1000 rpm离心5 min。
2. 弃上清，用新鲜培养基重悬。
频率：一般2–3天一次，根据细胞密度和培养基颜色调整。
2.传代（Passage）
当细胞达到70–90%汇合度时进行传代，以避免接触抑制和状态变差。
贴壁细胞（胰酶消化法）：
1. 弃上清，用PBS轻洗一次。
2. 加入适量0.25% Trypsin-EDTA，37℃孵育1–5 min，显微镜下观察细胞变圆、开始脱落。
3. 加入含血清的完全培养基终止消化。
4. 轻轻吹打，制成单细胞悬液。
5. 离心，弃上清，重悬于新鲜培养基。
6. 按比例（如1:3、1:5）接种到新的培养瓶中。
悬浮细胞：
-直接按比例稀释到新的培养瓶中，必要时先离心去除死细胞和碎片。
3.冻存与复苏
冻存步骤：
1. 收集对数生长期细胞，离心。
2. 用冻存液重悬（常用配方：培养基:血清: DMSO = 7:2:1或5:4:1，DMSO 5–10%）。
3. 分装入冻存管。
4. 放入程序降温盒，-80℃过夜，再转入液氮长期保存。
复苏步骤：
1. 从液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水浴，1 min内融化。
2. 立即加入大量预热的完全培养基，稀释DMSO。
3. 离心，弃上清。
4. 重悬，接种到培养瓶中。
5. 复苏后24 h内尽量不换液，让细胞恢复。
六、污染的识别与预防
1.常见污染类型
细菌污染：
-现象：培养基浑浊、变黄，显微镜下可见大量细小颗粒快速运动。
-处理：通常直接丢弃，避免扩散。
真菌/酵母污染：
-现象：培养基中出现絮状团块或丝状结构。
-处理：直接丢弃，彻 底清洁培养箱。
支原体污染：
-现象：培养基外观正常，细胞生长变慢、形态异常。
-危害：影响细胞代谢、基因表达和实验结果。
-检测：PCR、qPCR、荧光染色等。
-预防：定期检测，使用合格的血清和试剂，严格无菌操作。
七、细胞状态的日常监测
1. 每天观察：汇合度、形态、培养基颜色和是否有异常颗粒。
2. 记录：传代次数、冻存时间、使用的血清批次等，建立细胞档案。
3. 避免过度传代：细胞长期传代会出现基因型和表型漂移，建议使用早期代数。
八、实用小技巧
-新拿到的细胞系，先查阅ATCC、Cell Bank等官方资料，了解其最佳培养条件。
-同一细胞系尽量使用同一批次的血清和培养基，以保证实验的一致性。
-建立“备份细胞库”，在细胞状态良好时多冻存几管，防止污染或状态变差时“断档”。
-操作时保持耐心，避免“赶时间”导致的操作失误。
原创作者：北京缔一生物科技有限公司
