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技术文章
支原体常规检测方法汇总（之一）
点击次数：3787 发布时间：2021/11/22 9:35:32
养细胞的小伙伴，怕遇到的，大概就是细胞污染了。
这细菌和真菌污染好辨别，处理起来虽然麻烦，但也不是毫无办法。相比起来，支原体污染才是防不胜防。
显微镜很难捕捉到它们的身影，与细胞共存在同一培养体系下，还跟细胞吃喝。可怜弱小又无助的细胞根本不是支原体的对手，只能苟延残喘，状态一代不如一代，导致实验结果出现偏差。
多数情况下，发现细胞疑似支原体污染，直接丢掉然后清理环境即可。但在一些特殊实验，比如：细胞保种、抗体药生产、疫苗生产或是细胞治疗过程中，则需要对细胞例行支原体检测，以确保细胞的纯净。
支原体常规检测法之经典法
这里指的是基于经典法试剂盒：Venor®Gem qEP的检测方法。
关于qPCR大家应该都不陌生：
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）
是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
在支原体经典法检测试剂盒中，无需RNA提取和反转录步骤，样品仅需待检测的细胞上清或是从上清中提取的DNA。
经典法试剂盒：Venor®Gem qEP使用方法
一、样品制备：
①浓缩：当细胞长至90%时，即可收集上清开始检测，可对样品进行适当浓缩。
注：浓缩仅适用于支原体的完整性，避免浓缩支原体被破坏（如热灭活）。
②稳定：细胞培养样品可能含有丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原体DNA。因而推荐进行样品稳定化处理。如果立即进行DNA抽提，则忽略这一步。
③DNA 抽提：大量证据表明，DNA抽提可实现高的灵敏度。DNA抽提有多种方法，但应适合支原体基因组。我们推荐：
Venor®GeM Sample Preparation kits （货号56-1010/-1050/-1200) 适合手动DNA抽提
这些DNA抽提试剂盒已经过大量验证，具体流程参见试剂盒说明书。另外Venor®GeM qEP kit包含的内控DNA对照，也用于验证DNA抽提步骤（内控原理：已知浓度的细胞，包含内部控制DNA序列，该序列不和现有的任何有机体序列同源，对检测的DNA样品干扰小。在DNA提取，将该内控细胞和样品一起加入细胞裂解液中，被一起提取出来。和靶点样品一起进行荧光定量PCR实验，内控DNA序列的成功扩增提示靶点DNA的提取成功）。
二、试剂制备与PCR
另外，下列仪器已经通过PCR反应验证：
三、试剂制备与PCR
FAM通道检测支原体荧光信号。依据DNA标准曲线和Ct值定量。具体步骤需参考具体qPCR 仪及软件的功能。我们推荐对包括对照在内的每个样品的扩增曲线进行评估。
Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。
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原创作者：北京缔一生物科技有限公司
