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技术文章
支原体qPCR检测试剂盒的特点及操作步骤
点击次数：3863 发布时间：2021/11/16 11:12:05
特点
- 1. 内控对照为独立包装，遵循欧洲药典和日本药典操作流程。
- 2. 高特异性，一次检测即可涵盖所有常见易感染细胞的支原体物种（包括欧洲药典规定的9种支原体）。与细菌和真核DNA无交叉反应。
- 3. 高灵敏度，zui低检测限可达到≤10CFU/ml。
- 4. 有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。
- 5.有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于定量检测。
操作步骤
第1步：样本处理
a.细胞培养上清
b. 生物药或需遵循药典的样本
说明：
①样品基质可能会影响检测的灵敏度。收集和筛选更高的样品量可提高测定灵敏度。
②细胞培养物样本含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原DNA，影响检测灵敏度。 建议：样本做DNA抽提处理，实现高灵敏度。 推荐：德国MB公司生产的用支原体DNA提取试剂盒 Venor® Gem Sample Preparation Kit 该DNA抽提试剂盒已经过广泛验证。
第2步：试剂制备
a. 冻干粉溶解
b. 反应体系制备 b1) 样品为细胞上清筛查——反应体系制备
b2) 样品为生物药——反应体系制备
第3步：启动荧光定量PCR仪
第4步：结果判别 FAM通道：检测支原体荧光信号。HEX通道：检测内控对照荧光信号。 支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。 支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。 定量需基于Ct值和DNA标准曲线。 Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。
示意图：
储存条件 2~8℃保存至少12个月。复溶后-18℃以下保存
原创作者：北京缔一生物科技有限公司
