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技术文章
荧光定量PCR法（qPCR）检测试剂盒
点击次数：4355 发布时间：2021/1/19 8:55:31
荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。
优点：①灵敏度高、特异性强。
②时间短，2-3小时出结果。
③检测结果可定量。
④操作简便。
缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）
②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在业人员推荐指导下使用。
支原体荧光定量PCR检测试剂盒(qPCR经典法)(符合欧洲药典)-荧光定量PCR检测-北京缔生物科技有限公司
- 特点
- 1. 内控对照为独立包装，遵循欧洲药典和日本药典操作流程。
- 2. 高特异性，次检测即可涵盖所有常见易感染细胞的支原体物种（包括欧洲药典规定的9种支原体）。与细菌和真核DNA无交叉反应。
- 3. 高灵敏度，检测限可达到≤10CFU/ml。
- 4. 有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。
- 5.有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于后定量检测。 操作步骤
- 第1步：样本处理 a.细胞培养上清
- b. 生物药或需遵循药典的样本 说明：①样品基质可能会影响检测的灵敏度。收集和筛选更高的样品量可提高测定灵敏度。 ②细胞培养物样本含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原DNA，影响检测灵敏度。 建议：样本做DNA抽提处理，实现较高灵敏度。 推荐：德国MB公司生产的用支原体DNA提取试剂盒 Venor® Gem Sample Preparation Kit 该DNA抽提试剂盒已经过广泛验证。 第2步：试剂制备 a. 冻干粉溶解
- b. 反应体系制备 b1) 样品为细胞上清筛查——反应体系制备
- b2) 样品为生物药——反应体系制备
- 第3步：启动荧光定量PCR仪
- 第4步：结果判别 FAM通道：检测支原体荧光信号。HEX通道：检测内控对照荧光信号。 支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。 支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。 定量需基于Ct值和DNA标准曲线。 Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。
原创作者：北京缔一生物科技有限公司
