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线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒/分光光度法
价格：￥ 1442
品牌名称：$brandModel.Title型号： 原产地：中国大陆 更新时间：2026/10/19 10:49:03
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线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒说明书
注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素 C 氧化酶,也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责催化还原型细胞色素 C 的氧化,并最终把电子传递给氧,生成水。
测定原理:
还原型细胞色素 C 在 550nm 有特征光吸收,线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素 C 生成氧化型细胞色素 C,因此 550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:25mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二: 5mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:0.5 mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:液体 10mL×2 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×2 支,-20℃保存;
试剂六:粉剂×2 支,-20℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做)。
5、 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于复合体Ⅳ酶活性测定。
测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 550nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配制:临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支,将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(2)将工作液置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min;
(3)在 1mL 玻璃比色皿中加入 80µL 样本和 800µL 工作液,混匀,记录 550nm 处初始吸光值 A1 和 37℃
反应 30min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。
注意点:
1、 若 ΔA 大于 0.2,需将样本用试剂二稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数),使 A1-A2 小于0.2,可提高检测灵敏度。
2、 动物肝脏样本由于酶活性过高, 1 分钟内吸光值就会到达平台期,务必行 2 个样本的预测定。可将样本用试剂二稀释 10~50 倍,反应时间缩到到 30 秒或 1 分钟(计算公式中代入实际反应时间,并乘以相应稀释倍数)。其他样本可按照正常测定步骤进行。
复合体Ⅳ活力单位的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=3.88×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.008×ΔA
V 反总:反应体系总体积,8.8×10-4 L;ε:细胞色素 C 摩尔消光系数,1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.08 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。
热门标签：线粒体呼吸链复合体Ⅳ,线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒,分光光度法
