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甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒/微量法
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详细内容
货号:XYT9027
甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒说明书
注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
MCS 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,与柠檬酸合酶(CS)共同参与三羧酸循环的调节。
测定原理:
MCS 催化丙酰 CoA 和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶 A,进一步水解产生甲基柠檬酸;该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的 TNB,在 412nm 处有特征吸光值。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 1.5mL×1 支,-20℃保存;
试剂四:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加入 1mL 蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
④ 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。
⑤ 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 CS 测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)在试剂五中加入 1mL 无水乙醇和 22mL 试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10µL 样本、220µL 试剂五和 10µL 试剂六,混匀,记录 412nm处 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。
MCS 活性计算:
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下:

V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
仅用于科研,不能用于临床诊断!所有产品仅供科研使用,不得用于人或动物的治疗等任何其他用途,不为任何个人提供产品和服务。以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。
热门标签:甲基柠檬酸合酶(MCS),甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒,微量法
















