实验原理

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种基于抗原抗体反应的免疫学检测方法。其基本原理是利用抗原抗体的特异性结合，通过酶对底物反应的显色反应，对样本中的待测物质进行定量或定性分析。ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、适用范围广等特点，因此在生物医学研究、临床诊断和食品安全检测等域得到了广泛应用。

样品收集、处理及保存方法

1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。

3. 细胞上清液：3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟取上清。

5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解 冻并确保样品均匀地充分解冻。

标本的稀释原则：

先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。

标准品的稀释原则：

2瓶，每瓶临用以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为300 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用15分钟内配制。 如配制150 pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

生物su标记抗体的稀释原则：

临用以生物su标记抗体稀释液稀释，稀释根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物su标记抗体加990μl生物su标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用一小时内配制。

辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：

临用以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用一小时内配制。

实验步骤

1. 抗原包被：将抗原溶液加入到酶标板孔中，包被抗原，使其在孔底形成一层薄膜。

2. 清洗：清洗酶标板，去除未结合的抗原和其他杂质。

3. 阻断：加入阻断液，封闭酶标板孔中的非特异性结合位点，以减少非特异性结合。

4. 清洗：清洗酶标板，去除未结合的阻断液和其他杂质。

5. 加样：加入待测样本，使其与抗原发生特异性结合。

6. 清洗：清洗酶标板，去除未结合的样本和其他杂质。

7. 加酶标抗体：加入酶标记的抗体，使其与特异性结合的样本中的待测物质发生反应。

8. 清洗：清洗酶标板，去除未结合的酶标抗体和其他杂质。

9. 显色反应：加入底物溶液，发生酶催化反应，产生有色产物。

10. 终止反应：加入终止液，停止酶催化反应。

11. 检测：用酶标仪测定各孔的光密度值，记录数据。

ELISA试剂盒实验数据的计算处理方法

1、拟和曲线：

输入第1行： 浓度值， 如0 10 50 100 400

输入第二行：该浓度下的调整后的od值，如0 0.586 1.397 1.997 3.42

选择这些输入的数据，用插入里的图表按钮，进入图表向导，在“标准类型”中选择“xy散点图”;在“子图表类型”中选择“折线散点图”，按“下一步”;选择“系列产生在行”，按“下一步”;数据标志，可以填写：如数据y轴，OD值;数据x轴，浓度;按下一步，点击完成。可得曲线图。

单击曲线，按右键，选择“添加趋势线”，在类型中，选择多项式;在选项中，选择显示公式，选择显示R平方值。

得到公式和R平方值。

也可以用上面说的方法： 双击图表，把它输入到图表的数据中，就可以拟和曲线。

2、计算浓度：

第1次实验：

标准曲线为：

y = -4E-05x2 + 0.026x

R2 = 0.9745

为例，已知OD值，计算浓度。

由于y = -4E-05x2 + 0.026x，可以得到：

4E-05x2 -0.026x +y=0

ax2 +bx +y=0

注意事项

1. 试剂盒保存于2-8℃，切勿反复冻融或长时间保存于室温。

2. 实验确保所有试剂均已恢复至室温。

3. 加样时注意避免产生气泡。

4. 洗涤时要充分洗涤，避免残留物影响实验结果。

5. 底物溶液应避光保存，避免长时间暴露于空气中。

6. 酶标仪应使用450nm波长进行读数，其他波长可能导致误差。

7. 本试剂盒用于科研实验和诊断参考，不适用于临床诊断和治疗。

试剂盒 必知说明：

1）只有全部使用本试剂盒配套试剂才能检测效果，

2）不能混用其他制造商的产品，只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到好的检测结果。

3）由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

4）实验结果与试剂盒的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关。

5）请务必准备充足的标本备份。

6）不同批次的同一产品可能会有少许差别，

如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书作参考。

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