检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联吸附试验（ELISA）。往预先包被相关指标的抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的相关指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样本实验准备

在收集样本都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进行检测的样本，及时储存在4℃备用。对于隔天再检测的样本，及时分装后冻存在-20℃备用，有条件的，建议⁻⁷0℃冻存备用。标本应避免反复冻融。

液体类标本: 包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

1. 血清：

室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

2. 血浆：

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

3. 尿液：

用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4. 细胞培养上清：

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。

5. 培养细胞

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2⁻⁷.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6. 组织标本

切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

实验步骤

1. 样品收集与处理

（1）根据需要收集不同种类的样品，如血清、血浆、尿液等。

（2）对于血清和血浆样品，将采集的血液静置一段时间后，离心分离出血清或血浆。

（3）对于尿液样品，收集尿液后，可直接进行检测。

2. 样品稀释

根据试剂盒说明，对需要稀释的样品进行适当比例的稀释。

3. 加样

（1）按照试剂盒说明，分别将标准品、质控品和待测样品加入相应的孔中。

（2）每孔加入50μL，轻轻震荡混匀。

4. 封闭

根据试剂盒说明，加入适量的封闭液，覆盖板孔，并轻轻震荡混匀。封闭液一般为含有一定浓度的非特异性结合配体的溶液，可以降低非特异性结合的影响。

5. 洗涤

（1）将板孔洗涤液加入到每个孔中，轻轻震荡，然后倒掉洗涤液。重复洗涤3次，每次用洗涤液充分洗涤

（2）醉后一次洗涤后，用纸巾轻轻吸干板孔表面的水分。

6. 酶标二抗加入及孵育

（1）根据试剂盒说明，将酶标二抗加入相应的孔中。

（2）孵育一定时间后，将板孔中的溶液倒掉。

7. 洗涤与显色

（1）重复步骤5的洗涤过程。

（2）加入显色剂，孵育一定时间后，将板孔中的溶液倒掉。

8. 终止反应与读数

（1）加入终止液，终止酶促反应。

（2）用酶标仪在450nm波长处读取各孔的光密度值（OD值）。

实验注意事项

1. 抗原和抗体的储存：应严格按照说明书要求存放抗原和抗体，避免反复冻融和长时间暴露在高温环境中。同时要确保试剂盒未过期，以获得可靠的实验结果。

2. 加样技术：加样时应确保加入的体积准确且不产生气泡，避免加在孔壁的边缘，以免影响与固相表面的接触。加样时应在每孔的旁边放置一个加样对照孔，以监测加样的准确性和重复性。

3. 温育：温育是ELISA实验中的重要步骤，温育时间和温度的控制对于抗原抗体反应的进行和结果的影响至关重要。必须严格按照说明书要求进行温育，并注意保持恒温状态。

4. 洗涤：洗涤是ELISA实验中的一步，它可以去除未结合的物质，提高检测的特异性和灵敏度。洗涤时应确保每次洗涤时间充足，并更换洗涤液以确保洗涤效果。同时要避免在洗涤过程中产生气泡，以免影响洗涤效果。

结果分析

根据试剂盒提供的标准品浓度及对应的OD值，利用标准品绘制的标准曲线，计算待测样品的浓度。一般采用拟合曲线法或直线回归法进行数据处理，通过计算得到待测样品的浓度。

ELISA的发展史

1√ 目，分子生物学正在并肯定会让我们对整个生命科学有一个的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的。

2√ ELISA测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断更新和型标记物的应用。

3√ ELISA试剂盒它使我们对以一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。

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