实验原理

本试剂盒基于检测样本的特异性抗体包被酶标板，加入待测样本，样本与包被在酶标板上的特异性抗体结合，形成免疫复合物。清洗后加入酶标二抗，与免疫复合物结合，形成完整的三明治复合物。再加入底物溶液，底物在酶的作用下变色，颜色的深浅与样本的浓度呈正相关。加入终止液，使反应停止，在450nm波长下测量各孔的光密度值（OD值），通过标准曲线计算样本的浓度。

实验步骤

1. 样品收集与处理

（1）根据需要收集不同种类的样品，如血清、血浆、尿液等。

（2）对于血清和血浆样品，将采集的血液静置一段时间后，离心分离出血清或血浆。

（3）对于尿液样品，收集尿液后，可直接进行检测。

2. 样品稀释

根据试剂盒说明，对需要稀释的样品进行适当比例的稀释。

3. 加样

（1）按照试剂盒说明，分别将标准品、质控品和待测样品加入相应的孔中。

（2）每孔加入50μL，轻轻震荡混匀。

4. 封闭

根据试剂盒说明，加入适量的封闭液，覆盖板孔，并轻轻震荡混匀。封闭液一般为含有一定浓度的非特异性结合配体的溶液，可以降低非特异性结合的影响。

5. 洗涤

（1）将板孔洗涤液加入到每个孔中，轻轻震荡，然后倒掉洗涤液。重复洗涤3次，每次用洗涤液充分洗涤

（2）后一次洗涤后，用纸巾轻轻吸干板孔表面的水分。

6. 酶标二抗加入及孵育

（1）根据试剂盒说明，将酶标二抗加入相应的孔中。

（2）孵育一定时间后，将板孔中的溶液倒掉。

7. 洗涤与显色

（1）重复步骤5的洗涤过程。

（2）加入显色剂，孵育一定时间后，将板孔中的溶液倒掉。

8. 终止反应与读数

（1）加入终止液，终止酶促反应。

（2）用酶标仪在450nm波长处读取各孔的光密度值（OD值）。

实准验备

在收集样本都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进行检测的样本，及时储存在4℃备用。对于隔天再检测的样本，及时分装后冻存在-20℃备用，有条件的，建议⁻⁷0℃冻存备用。标本应避免反复冻融。

液体类标本: 包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

1. 血清：

室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

2. 血浆：

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

3. 尿液：

用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4. 细胞培养上清：

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。

5. 培养细胞

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2⁻⁷.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6. 组织标本

切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，

按曲线方程计算各样本浓度值。

免责声明

试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或生物体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担， 本公司概不负责。

严格按照说明书操作，不同批号不可交换使用，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。

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