PCR-ELISA 端粒酶检测法

PCR‑ELISA 端粒酶检测法（TRAP‑ELISA，端粒重复扩增 - ELISA）

本质：TRAP（端粒重复扩增）+ 核酸杂交 ELISA，用来检测端粒酶的酶活性（不是测蛋白含量，是测功能活性），经典商品化方法就是 Roche TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA。
核心逻辑：端粒酶是逆转录酶，能在生物素标记的 TS 引物 3’端不断添加TTAGGG端粒重复序列；扩增产物再用 ELISA 固相杂交显色，用 OD 半定量端粒酶活性，替代传统 TRAP 的聚丙烯酰胺凝胶电泳，通量更高、无放射性。

一、基本原理

端粒酶体外延伸反应：样本裂解上清里的活性端粒酶，在 25℃条件下，以自身 RNA 为模板，向生物素标记 TS 引物的 3’端逐个加上 TTAGGG 重复序列，产生长度不一的端粒延伸产物。

PCR 扩增（TRAP 扩增）：升温灭活端粒酶，再用 TS 引物 + 反向锚定引物 P2，对端粒酶延伸出来的产物做 PCR 扩增，得到带生物素标记的双链扩增片段。体系内同时加入内参标准模板（internal standard），用来排除 PCR 抑制物造成的假阴性。

核酸杂交 + ELISA 固相捕获：PCR 产物变性成单链，加入DIG 标记的端粒重复序列探针；探针只和含 TTAGGG 重复的扩增产物杂交。

亲和固定与免疫显色：杂交复合物上的生物素结合酶标板上包被的链霉亲和素，把杂交产物固定在板上；洗板后加入HRP 标记抗 DIG 抗体，识别探针上的；TMB 底物显色，测 OD450。

定量逻辑：OD 值与 PCR 产物量正相关，而 PCR 产物量取决于样本中有功能活性的端粒酶，以此半定量端粒酶活性。

区分重点：

间接 ELISA：测蛋白抗体（抗原 - 抗体免疫反应）

TRAP‑ELISA：测端粒酶酶活性，属于核酸杂交 ELISA，不是抗原抗体包被，是生物素 - 链霉亲和素 + 核酸探针杂交。

二、完整操作流程与每一步作用

1. 样本制备（细胞 / 组织裂解）

操作：细胞 / 冰冻组织，冰上加裂解液，冰浴 30 min；4 ℃ 16000 g 高速离心，取上清，冰上操作。
作用：裂解细胞膜，释放胞内端粒酶；全程低温，保护端粒酶蛋白活性；离心去除基因组 DNA、细胞碎片。

对照准备：阳性对照（端粒酶阳性细胞提取液，如 HeLa）；热灭活对照（85℃ 10~15 min 灭活端粒酶，用来排除非特异扩增假阳性）；裂解液空白对照。

2. TRAP 步：端粒酶引物延伸（25 ℃，30 min）

操作：取样本上清加入 PCR 混合液（含生物素 TS 引物、dNTP、缓冲液、Taq 酶、内参模板），25℃孵育。
作用：活性端粒酶发挥催化功能，在 TS 引物末端添加 TTAGGG 重复序列；没有活性端粒酶的样本，不会产生延伸产物，后续 PCR 无目标条带。

3. 端粒酶灭活 + PCR 扩增

操作：94 ℃ 5 min，灭活端粒酶；然后 PCR 循环（94℃30s，50℃30s，72℃90s，一般 30 循环），72℃终延伸。
作用：高温终止端粒酶延伸反应，防止继续合成；Taq 酶对端粒酶延伸产物进行指数扩增；内参同步扩增，用来判断样本里有没有 PCR 抑制剂（如果内参信号消失，说明样本有抑制物，结果无效）。

4. PCR 产物变性

操作：取 PCR 产物，加入变性试剂，室温孵育 10 min。
作用：双链 DNA 解旋，变成单链，才能和标记的端粒探针杂交。

5. 液相核酸杂交

操作：加入含 DIG 标记端粒特异性探针的杂交液，孵育。
作用：探针特异性识别、结合含 TTAGGG 重复的单链扩增产物；不结合无关 DNA。

6. 链霉亲和素包被板捕获杂交产物

操作：将杂交混合液加入链霉亲和素预包被酶标板，孵育；PBST 洗板。
作用：产物上的生物素与板上链霉亲和素特异性结合，把杂交复合物固定在固相；洗板去除未杂交的游离探针、游离 DNA。

7. 加入 HRP 标记抗 DIG 抗体，孵育、洗板

操作：加 HRP - 抗 DIG 抗体，室温孵育；充分洗板。
作用：抗体特异性结合探针上的 DIG，给目标核酸复合物带上 HRP 酶标记；洗板洗掉未结合的游离酶标抗体，降低背景。

8. TMB 底物显色，终止，读板

操作：TMB 避光显色；加硫酸终止；酶标仪读取 OD450（参比 630nm）。
作用：HRP 催化 TMB 显色，OD 反映固相上捕获的杂交产物总量，间接反映端粒酶活性。

9. 结果判读

热灭活对照：OD 应很低，用来扣除 DNA 污染 / 非特异扩增的假阳性。

内参信号：必须检出，否则样本含 PCR 抑制物，实验作废。

计算：样本 OD 减去空白本底，再和阳性对照对比，得到相对端粒酶活性。

三、关键优缺点

✅优点

不用跑胶，高通量微孔板检测，适合批量样本；无放射性。

灵敏度高，可检测少量细胞的端粒酶活性。

半定量，可比较不同样本间端粒酶活性高低。

❌缺点

测的是酶活性，不能直接反映 hTERT 蛋白表达量；蛋白存在但失活时，结果阴性。

容易受 PCR 抑制剂影响（组织样本常见），必须设置内参。

存在 PCR 扩增偏差，只能半定量，不是绝对定量。

不能区分端粒酶延伸产物的条带模式，丢失凝胶 TRAP 的阶梯条带信息。

四、关键对照（必不可少）

阳性对照：HeLa 细胞裂解液，验证整套 TRAP+ELISA 体系有效。

热灭活对照：同一份样本 85℃灭活端粒酶，用来扣除基因组 DNA、引物二聚体等带来的假阳性。

裂解液空白对照：只加裂解液，无细胞，排除试剂污染。

PCR 内参：监控是否存在 PCR 抑制，避免假阴性。

五、常见干扰与问题

样本核酸酶、多酚、多糖：抑制 Taq 酶，内参消失，假阴性。

端粒酶极易失活：取材、裂解全程冰上，反复冻融会快速丢失活性。

引物二聚体：会轻微抬升背景，需要引物设计和循环数优化。

杂交非特异结合：探针特异性、洗板强度影响背景。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司