间接 ELISA 检测抗体总量的操作流程中，每一步的作用是什么？

1. 包被（抗原包被酶标板）

操作：将纯化抗原稀释后加入酶标孔，4℃过夜，洗板拍干。
作用：把抗原固定在聚苯乙烯固相孔壁上。固相载体依靠疏水相互作用吸附蛋白抗原，为体系提供捕获靶标抗体的结合位点。洗板去除未吸附游离抗原，避免游离抗原干扰后续抗体结合。

2. 封闭

操作：加入封闭液（BSA / 脱脂奶）孵育，之后洗板。
作用：酶标板表面还有大量未结合抗原的空白疏水位点，这些位点会非特异性吸附样本、二抗蛋白，造成背景 OD 偏高。封闭蛋白占据这些空白位点，阻断非特异吸附，降低假阳性。洗板去除未结合的封闭蛋白。

3. 加标准品、待测样本及对照并孵育，洗板

操作：加入梯度标准抗体、待测样本、各类对照，孵育后洗板。
作用：样本 / 标准品中的抗原特异性抗体（目标抗体）与固相上包被抗原发生特异性结合，锚定在板上。
孵育给抗原 - 抗体足够时间完成免疫结合；洗板非常关键，洗掉所有没有结合在板上的物质：未结合的杂蛋白、无关 IgG、游离抗体。

标准品：建立浓度 - OD 响应曲线，用于定量；
阴性对照：评估基质本身带来的背景信号；
空白孔：扣除试剂本身的本底吸光值。

4. 加入酶标二抗，孵育，洗板

操作：加入 HRP 标记二抗孵育，洗板。
作用：酶标二抗特异性识别已经结合在板上的目标抗体恒定区，二抗上携带 HRP 酶，相当于给目标抗体带上 “信号标记”。
孵育让二抗充分结合靶抗体；洗板去除游离未结合的酶标二抗。如果残留游离二抗，会直接催化底物显色，大幅抬升背景。

5. TMB 底物避光显色

操作：加入 TMB 底物，避光孵育。
作用：HRP 酶催化 TMB 发生氧化反应，生成蓝色有色产物。有色产物的量，和孔壁上结合的 HRP 量成正比，也就是和结合上去的特异性抗体量正相关。避光是防止 TMB 被自然光氧化自发显色，避免假信号。显色时间不能过长，防止信号饱和。

6. 加终止液终止反应，酶标仪读 OD

操作：加入硫酸终止液，读取 OD450。
作用：酸性条件下 HRP 酶失活，氧化反应立刻停止；同时蓝色 TMB 产物在酸性环境转变为稳定黄色，吸光度在 450nm 下稳定可测。
酶标仪读取吸光度，OD 值反映有色产物多少，作为定量原始数据。

7. 数据拟合与计算

操作：四参数拟合标准曲线，代入样本 OD 计算浓度，乘以稀释倍数。
作用：标准抗体梯度建立浓度 - OD 响应曲线，把待测样本的 OD 值换算成稀释后抗体浓度；再乘稀释倍数还原原始样本里的抗体含量。同时筛选掉超出曲线有效区间的样本结果（高浓度钩状效应、低于检测下限的样本）。

简要总结逻辑链

包被抗原（捕获位点）→封闭（堵空白位点降背景）→样本抗体结合固相抗原（捕获目标抗体）→酶标二抗标记抗体（带上酶信号）→底物显色（转化为光信号）→终止 + 读板（采集信号）→标准曲线换算浓度（定量抗体）

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司