抗体的保存温度对其活性有哪些影响？

抗体本质是 IgG 球状蛋白，依靠空间构象（Fab 抗原结合区、Fc 区）维持活性与特异性。温度主要改变蛋白分子运动速率，同时影响蛋白酶、微生物、氧化反应的速度；过高或者反复的温度波动都会破坏结构，不一定直接让蛋白沉淀析出，很多时候发生局部部分变性：Fab 还保留一部分结合能力，但 Fc 疏水暴露，带来背景升高、特异性变差。

高温（室温、37℃及以上）

温度升高，分子热运动变强，IgG 氢键、疏水作用力被破坏。
首先是构象的柔性区域先发生松动，不一定完全变性沉淀。短期室温放置几小时一般尚可耐受；长时间室温存放，Fab 结构慢慢受损，抗原结合亲和力逐步下降。同时体系里微量蛋白酶活性上升，会水解 IgG 的铰链区，切出 Fab、Fc 片段。如果是稀释后的工作液，高温还会加速微生物繁殖，微生物分泌的蛋白酶进一步切割抗体。
高温带来的典型后果：靶信号逐步减弱；更多的是非特异性背景、杂条带增多；严重之后 IgG 完全解折叠，出现浑浊沉淀。
对于标记抗体（HRP、荧光标记抗体），高温还会直接破坏标记基团，酶活或者荧光直接丢失，蛋白本身 IgG 还在，但检测信号消失。

4℃冷藏

低温可以明显降低蛋白热变性速率，抑制大部分蛋白酶活性，也大幅放缓微生物增殖速度。
4℃适合已经稀释好的抗体工作液短期储存。但 4℃不是完全停止所有化学反应。蛋白酶只是活性被抑制，并没有失活；微生物只是生长变慢，依旧可以缓慢增殖。同时溶液中已经存在的游离抗原碎片还会持续形成可溶性免疫复合物。
所以 4℃下抗体依旧是缓慢劣化的过程，只是速度变慢。浓缩的原液 4℃只适合数天到几周临时存放，不适合长期保存；稀释回收工作液 4℃只能短期使用，不能长期放置。添加抑菌剂（叠氮钠）只能抑制细菌，不能阻止 IgG 本身缓慢构象改变以及免疫复合物累积。

-20℃冷冻保存（浓缩抗体原液常用）

冷冻的优势是极大降低分子运动、酶活性，适合浓缩原液长期保存。
但冷冻本身对 IgG 存在一定伤害。水溶液结冰过程，盐浓度发生局部骤升，冰‑液相界面会产生应力，有可能造成 IgG 局部构象扰动。损伤主要来自反复冻融：每一次冻融循环，蛋白经历结冰再融化，部分 IgG 发生局部解折叠，逐步形成可溶性寡聚体。肉眼看不到沉淀，但疏水暴露之后后续实验背景明显上升。
所以浓缩抗体原液需要预先分装成小体积，做到一次拿出来融化一次用完，规避反复冻融。
重点区分：稀释后的抗体工作液不建议‑20℃冻存。稀释后 IgG 分子浓度低，蛋白分子之间的相互保护作用减弱，冻融更容易诱发聚集变性；这也是回收的 WB 一抗工作液不建议冷冻的根本原因。

-80℃超低温

超低温对于浓缩抗体原液稳定性，变性速率最低。一般多用于长期储备珍贵抗体，分装保存。同样要避免反复冻融。普通常规抗体日常不需要‑80℃，‑20℃分装冻存已经够用。稀释的工作液依旧不建议‑80℃冻存，低浓度 IgG 在冻融时依旧容易发生聚集。

温度波动的危害（经常被忽视）

冰箱门反复开关、拿取样品带来温度起伏；或者放于冰箱门位置，温度忽高忽低。温度来回震荡，IgG 不断经历升温降温，会加速结构的松动。比稳定维持某一个低温环境的损伤更大。回收抗体尽量放置在冰箱内部固定搁架，不要放在冰箱门处。

原液与回收稀释工作液的差异总结

高浓度的原液，蛋白分子互相之间有一定的构象保护，耐受冷冻能力更强，可以分装‑20℃长期保存。
稀释之后的回收工作液 IgG 浓度低，缺少这种保护；冷冻‑解冻很容易局部变性，优先 4℃短期密封储存。

保存温度带来两类损伤结果，要区分开

类，结合活性整体下降：Fab 结构被破坏，靶抗原结合能力丢失，阳性信号直接变弱消失。
第二类，特异性受损（部分变性），Fab 还能识别靶抗原，但是 Fc 疏水区域暴露，出现杂带、弥散背景升高。这种损伤肉眼看液体依旧清亮，很容易被忽略；回收复用抗体最容易遇到这一类损伤。
因此保存温度仅仅是延缓劣化的手段，无论什么温度保存，回收抗体每次使用前依旧需要做活性以及特异性的质控，不能只依靠储存条件判断还能不能继续使用。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司