抗体可以重复使用的次数是多少?

首先要明确不存在一个绝对固定的复用次数，复用上限本质不是次数，而是抗体活性下降、杂蛋白杂质累积带来背景升高，次数只是实验室的经验参考。只讨论无酶标记的 WB 一抗；HRP 标记二抗不建议任何形式回收复用，定量 WB 实验建议直接使用新鲜抗体，不要复用。

先区分多克隆抗体与单克隆抗体。多克隆抗体整体耐受更好，每一次孵膜只会消耗一部分有效 IgG，杂质累积速度相对慢，日常 4℃孵育之后回收，经验上最多可以复用 2‑4 次。单克隆抗体本身稳定性偏弱，不可逆吸附损失的影响更明显，杂质很容易造成背景升高，一般建议最多复用 1‑2 次就不再继续使用。

这里的次数前提有很多约束条件。回收只能是 4℃摇床孵育结束之后收集的工作液，如果是室温过夜孵育后的抗体，直接丢弃，不进行复用。回收之后 4℃冷藏保存，每次回收之后尽量密封，可补加叠氮钠抑菌，不能反复冻融回收后的工作液。每一次孵育的膜面积也会影响实际可复用次数，如果每次孵育很大面积的 PVDF 膜，IgG 非特异性吸附损失变多，有效抗体消耗更快，实际能够复用的次数还会进一步变少。如果每次只是孵育小尺寸膜条，损耗会偏低，可以更靠近经验上限。

不能单纯靠计数次数来决定要不要继续用，次数只是参考，每一次回收再使用之前都要做阳性质控验证。取固定的阳性蛋白样本，一边用新鲜配制的一抗做对照，一边用回收抗体孵育，其余 WB 所有条件保持一致。合格的状态是目标条带灰度相比新鲜对照组下降不超过百分之二十到三十，同时整张膜背景没有明显抬升。只要出现特异性条带明显减弱，或是背景、杂带开始加重，无论现在才复用了第几次，都要直接废弃这管回收抗体，不可以继续使用。

还有样本丰度带来的取舍。高丰度表达的靶蛋白对抗体效价下降容忍度更高，适合回收复用；低丰度弱表达的靶蛋白本身信号余量很小，轻微的抗体损耗就会直接丢失条带，这类靶蛋白直接使用新鲜稀释抗体，不要冒险回收。

总结一下，2‑4 次多抗、1‑2 次单抗只是经验参考值。真正的终止条件不是计数次数，而是每一轮的 WB 质控结果。杂质是复用最大的限制因素，多次孵育之后从 PVDF 膜洗脱下来的变性抗原碎片不断累积，就算特异性抗体活性还尚可，背景抬升之后这管抗体就已经没有继续使用的价值，补加新鲜母液也无法消除已经存在的杂质。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司