如何通过实验确定抗体的保存期限？

这里测定对象是稀释后的一抗工作液，包括新鲜配制的稀释工作液以及孵育过膜的回收一抗工作液。原装母液优先参考厂家说明书，如果需要验证母液稳定性，也可以沿用这套实验思路。整套实验的核心思路是设置时间梯度做实时冷藏稳定性试验，最终同时监测抗体特异性结合活性以及非特异性背景这两项指标，不能只看液体外观或者单纯参考经验天数。

首先开展 4 摄氏度实时稳定性试验，这是判定保存期限的主体实验。先一次性配制一批待测的抗体工作液，如果是回收抗体就要直接使用真实回收后的液体，不可以拿新鲜稀释抗体来替代回收样品，回收体系基质含有从膜上洗脱的变性蛋白碎片，本身稳定性和新鲜工作液并不一样。配好之后把工作液分装成多份密封保存，分装的目的是每个时间点只取出一管进行检测，规避反复开盖带来的微生物污染干扰实验结果。

接下来设定一系列取样时间点，从第 0 天也就是刚配制完成的初始样品开始，后续根据预估的寿命设置时间梯度，比如一天、三天、五天、七天、十天、十四天。还可以根据实验需求增设组别，一组添加叠氮钠作为抑菌剂，另一组不添加抑菌剂，用来评估抑菌剂对保存寿命带来的影响。

到达每一个取样时间点就取出对应的一管抗体，统一使用同一批次的阳性蛋白样品来跑 WB。第 0 天新鲜的抗体作为阳性对照，后续所有实验条件要保持完全一致，封闭时间、洗涤次数、二抗都使用同一管新鲜的二抗，ECL 发光底物以及相机曝光参数全部固定。每个时间点建议设置两到三次生物学平行，减少跑胶转膜带来的随机误差。

评判的时候分为三个层面，每次取样首先肉眼观察液体状态，查看是否出现浑浊、絮状沉淀或者颜色改变，一旦出现这类理化变化就可以直接判定样品失效。再分析 WB 成像结果，以第 0 天的条带灰度作为基准，一般将条带灰度保留百分之七十到八十作为活性合格的下限，如果灰度下降超过百分之二十到三十，就代表抗体特异性活性已经不足。除了特异性条带之外还要评估整张膜的非特异背景以及杂带情况，即使特异性条带信号还维持在合格范围，只要背景出现明显抬升，同样判定样品失效。最终的实测保存终点取所有指标里面失效的时间点，也就是该条件下实测得到的最大保存期限。

加速稳定性试验可以作为前期快速筛查手段，但不能直接用来确定正式保存期限。做法是将分装后的抗体放置三十七摄氏度进行储存，设置小时级别的时间梯度取样，后续依旧采用 WB 检测灰度和背景。升温会加快抗体蛋白变性，如果三十七摄氏度很短时间内就出现信号明显下降，就提示这一批抗体本身蛋白稳定性偏弱，预示四摄氏度条件下的存放寿命也不会很长。需要特别注意加速稳定性的数据不能直接换算成四摄氏度的实际保质期，正式结论仍然依靠四摄氏度实时时间梯度的结果。

实验过程当中要注意排除各类干扰。不同时间点的蛋白样品尽量使用同一批制备的蛋白，减少上样样本差异；二抗和 ECL 底物都要使用新鲜试剂，避免二抗或者发光试剂自身活性衰减，误判成一抗失活；分装的时候做好密封处理，区分细菌污染失效和抗体蛋白本身变性失活两种情况。

总结，稀释之后的抗体工作液保存期限高度依赖抗体本身特性、稀释保护基质、是否经过膜回收处理以及抑菌剂添加情况，没有通用固定数值。厂家说明书标注的保质期大多只针对原装母液，稀释后的工作液厂家一般不会给出保质期，需要自行完成四摄氏度实时梯度 WB 稳定性测试。判定终点必须同时结合条带活性灰度、非特异背景水平以及液体理化外观，取发生失效的时间作为最终实测保存期限。回收一抗每一次孵育膜之后体系内杂质都会继续累积，所以每一轮回收之后的保存寿命都需要重新评估，不能直接沿用之前新鲜稀释或者上一轮回收测得的保存时间。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司