抗体稀释液的选择对实验结果有哪些影响？

抗体稀释液不只是用来把抗体调至目标浓度的溶剂，它会直接影响抗体分子的构象、非特异性吸附、抗原‑抗体结合效率，进而改变条带信号、背景以及特异性。常用的稀释体系主要是 TBST 基础上添加封闭蛋白，也就是脱脂奶粉或者 BSA，也有直接只用 TBST 做稀释液的情况。

首先讲只用单纯 TBST 作为抗体稀释液的情况。TBST 提供中性的盐离子与轻微去污剂 Tween‑20，可以减少疏水吸附。但稀释液内部没有蛋白保护成分，抗体分子在稀溶液状态下很容易发生疏水聚集。被稀释后的 IgG 蛋白稳定性下降，一部分抗体发生吸附到管壁或者自身聚集沉淀。最终表现为目的信号下降，同一次实验重复性变差。同时缺少游离蛋白竞争，抗体更容易直接非特异吸附到 PVDF 膜空白位点，背景有升高的风险。单纯 TBST 一般不推荐作为长期孵育（4℃过夜）的抗体稀释液，短时间室温孵育偶尔可以使用。

使用脱脂奶粉 TBST 作为抗体稀释液，也就是奶稀释液。奶粉里面含有多种混合蛋白，可以作为保护蛋白，稀释之后维持 IgG 的可溶性，降低抗体的疏水聚集。游离奶蛋白还可以竞争性占据膜上部分疏水空白位点，减少抗体非特异性吸附，通常有助于压低整体背景，成本也比较低。但是奶粉体系存在明显短板，牛奶里面含有内源的磷酸化蛋白。如果检测磷酸化靶蛋白，奶里面的磷酸化蛋白会与一抗发生结合，直接造成目的磷酸化信号被压低，条带变弱甚至消失。另外牛奶里面还有少量生物素，做生物素‑链霉亲和素体系检测时也会带来干扰。奶粉成分属于混合物，不同批次奶粉之间组分存在差异，会给实验引入额外的批间波动。

BSA‑TBST 稀释液，也就是牛血清白蛋白溶于 TBST。BSA 是单一的蛋白组分，可以起到保护抗体、减少 IgG 聚集的作用。相比脱脂奶，BSA 不含内源磷酸化蛋白，是磷酸化蛋白 WB 的稀释液；也没有游离生物素干扰。不过 BSA 也有不足，市售 BSA 品质差异很大，如果 BSA 本身含有 IgG 杂质，就会引入额外的 IgG，孵育之后二抗可以识别这部分杂质 IgG，造成非特异杂带和背景升高。要尽量选用无 IgG、低内毒素等级别的 BSA。同时 BSA 抑制非特异性吸附的效果整体略弱于脱脂奶粉，部分普通总蛋白 WB 使用 BSA 时背景会比奶体系略高一点。

除了蛋白添加物之外，稀释液里面的盐浓度、pH、Tween‑20 含量同样会影响结果。pH 偏离抗体适宜的中性区间，会改变抗体可变区电荷，直接降低抗原抗体结合亲和力，造成信号减弱。盐离子过低会增强静电吸附，升高非特异背景；盐浓度过高又会削弱抗原‑抗体之间的静电相互作用，造成特异性信号下降。Tween‑20 属于非离子去污剂，低浓度可以减弱疏水吸附；但如果稀释液里 Tween‑20 浓度过高，有可能破坏抗原‑抗体的弱结合，直接造成条带信号降低。

还有防腐剂的问题，部分用户会向抗体稀释液添加叠氮钠。一抗稀释体系少量叠氮钠对结果影响不大；但 HRP 标记的二抗稀释液严禁加入叠氮钠，叠氮钠可以抑制 HRP 酶活性，后续化学发光直接信号变弱甚至无光。

抗体稀释液和封闭液之间也存在匹配关系。封闭液用了奶粉，一抗稀释液优先奶粉；封闭液用 BSA，稀释液优先 BSA。如果封闭和抗体稀释选用的蛋白体系不一致，也有可能改变背景水平。另外要注意，稀释液只是改善抗体的溶解与非特异吸附，并不能补救抗体本身浓度不合适的问题，也不能修复已经变性失效的抗体。

落到最终实验现象上的总结。选错稀释液的典型现象分为几类。磷酸化蛋白用奶粉稀释，目的条带明显变弱甚至无信号；普通蛋白使用纯 TBST 稀释过夜孵育，重复性差、背景偏高；低纯度 BSA 做稀释液，莫名出现杂带；稀释液 Tween‑20 或者盐浓度不合适，信噪比整体下降。合适的稀释液可以维持稀释状态下抗体蛋白的可溶性，降低非特异性吸附，稳定抗原抗体结合，得到信噪比好并且重复性稳定的 WB 结果。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司