如何判断抗体是否失效？

WB 中如何判断抗体是否失效

首先要区分抗体失效和实验操作问题，很多时候条带弱并不是抗体坏了，而是转膜、上样、封闭、稀释、洗涤带来的问题，不能直接判定抗体失效。

先看储存与外观状态。液体抗体如果出现明显浑浊、絮状沉淀，分层，颜色发生异常加深改变，冻融次数过多，长期反复室温放置，大概率活性受损。分装保存的抗体比整管反复冻融更稳定；一抗尤其怕反复冻融，反复冻融容易造成 IgG 蛋白聚集变性，抗原结合位点被破坏。二抗相对更耐受，但长期存放也会慢慢失活。

然后通过实验现象来判断。如果抗体已经失效，最典型的表现就是目的条带完全消失或者信号极度微弱。在确定样品本身没有问题，转膜确认蛋白已经转到膜上，内参抗体可以正常跑出清晰条带，同一体系其他抗体结果正常的前提下，只有这一个目标抗体完全没有条带，同时整张膜背景很低，几乎没有任何杂带，就需要怀疑该抗体活性下降。
如果只是背景高、杂带多，一般不是失效，反而大多是抗体浓度偏高或者非特异性吸附；失效的抗体通常是连信号都出不来，不会产生很重的背景。这点很关键，失效不等于背景差，失活之后能够结合膜的抗体变少，本底反而干净。

接下来可以做验证实验，用来排除操作因素。优先用已知阳性的阳性对照样品进行孵育，阳性样品确定跑不出条带，才更支持抗体失效。可以同时拿同批次的内参抗体在同一张膜孵育，内参正常显色，就排除电泳转膜、发光底物、二抗、曝光整套系统的问题。如果怀疑一抗失活，可以换一支确认有效的二抗排除二抗的问题；反过来，如果怀疑二抗失效，可以拿一支确定好用的一抗来测试二抗显色能力。
也可以做抗体梯度测试，逐步提高抗体浓度，减少稀释倍数。即使把抗体调高几倍浓度之后，阳性样品依旧得不到条带，基本可以确认活性下降；如果调高浓度之后条带重新出现，说明原来只是稀释度过高，抗体本身没有失效。

还要区分不同情况，抗体部分失活也是很常见的，不是直接完全失效。部分失活的时候，不是完全没有条带，而是同等实验条件下，和之前的实验结果对比条带信号明显变弱，需要大幅度延长曝光时间才勉强看见条带；同时杂带可能变少。这种时候抗体还残存一部分活性，不建议继续用于半定量，仅勉强可以做定性，结果可靠性会下降。

另外还有几个干扰情况容易误判。底物失效、PVDF 转膜失败、样品抗原降解，都会看不到条带。验证抗体之前要先确认其他环节没问题。不要仅凭一次实验无条带就丢弃抗体，优先重复一次阳性对照。
还有一个补充点，干粉抗体复溶之后稳定性会明显变差，复溶之后一定要分装冻存，不要整管反复取用；已经开封使用的一抗，即使在 4℃保存，放置数月之后活性也会逐步衰减。

简单总结判断逻辑：
整套系统确认没问题（内参正常、底物发光正常、阳性样品完好、转膜确认成功），阳性对照样品，提高抗体浓度依旧得不到条带，结合抗体储存不当、外观浑浊沉淀，就判定抗体失效；调高浓度之后条带恢复，说明只是稀释问题，抗体本身活性还保留；条带弱但加大曝光才隐约出条带，属于部分失活。
如果出现大量杂带、背景很重、发生反影，一般不属于抗体失效，优先排查浓度、封闭和洗涤。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司