如何判断抗体是否需要稀释？

WB 如何判断一抗二抗是否需要稀释

先可以从最终曝光的结果反向判断抗体浓度是否合适。

如果膜整体背景灰蒙蒙，即使短时间曝光本底就已经升上来，或是直接出现反影黑底白条的现象，膜上分布很多无关杂带，目的条带边缘晕染扩散、条带变粗模糊，这些现象都提示抗体浓度偏高，需要进一步稀释。这里要注意，就算目的条带看着还不错，只要背景偏高，依旧属于抗体偏浓，不能只盯着目标条带判断。

如果背景很干净，但是目的条带信号很微弱，延长曝光之后条带提升也不明显，内参同样偏淡，条带若有若无断断续续，这种情况说明抗体浓度偏低，应当减少稀释倍数，适当提高抗体工作浓度。

理想的抗体稀释状态是，较短曝光时间就可以得到锐利清晰的目的条带，整张膜背景干净，几乎没有多余杂带。适当延长曝光之后，条带和背景只是同步缓慢加深，不会快速出现大片本底，也不会很快发生信号反转变成反影。

正式实验之前优先做梯度预实验，提前摸索合适的稀释比例，二抗的信号放大效应更强，优先做二抗的梯度再做一抗。以说明书给出的推荐稀释比例作为中间档位，向更高浓度和更低浓度两端设置梯度。可以把同一张转好的 PVDF 膜裁成若干小条，每一个小条使用一个稀释梯度孵育抗体，电泳上样用同一批样品，洗涤、发光底物还有曝光条件全部保持一致。之后对比每一条的结果，优先挑选目的条带信号足够强同时整体背景最低的稀释档位。

这里有几个常见误区需要留意。不要直接把说明书的稀释比例当作工作浓度，说明书只是参考范围。实际浓度会受到蛋白上样量、转膜效果、发光底物灵敏度的影响。如果使用高灵敏度超敏发光底物，一抗和二抗往往要比说明书再进一步稀释，否则很容易过曝出现反影。也不要认为条带颜色越黑，抗体浓度就越好，条带过黑晕染，甚至很快反影，代表信号已经饱和，这种结果不适合用来做 WB 半定量分析。另外不能只看目的条带，忽略整张膜的背景情况，有些时候目标条带尚可，但本底已经偏高，后续稍微延长曝光就会发生反影。洗涤步骤也不能够替代抗体稀释，TBST 洗涤只能去除膜上松散吸附的游离抗体，由抗体非特异性结合带来的本底，只能通过降低抗体工作浓度来改善。

结合反影的情况针对性判断，出现反影之后首先做梯度曝光测试。如果仅仅缩短曝光时间就变回正常正像，不一定马上稀释抗体，优先调整曝光的采集窗口就可以。但如果已经用很短的曝光时间依旧是反影，背景始终降不下来，就说明抗体浓度偏高，优先稀释二抗，二抗调整无效之后再去稀释一抗，同时增加 TBST 洗涤的次数以及单次洗涤时长。

对于半定量 WB 来说，选择抗体稀释度的时候，还要额外确认信号没有到达饱和区间。可以观察梯度上样的样品条带，蛋白上样量提升时条带的亮度可以同步随之增强，这就说明抗体浓度合适；如果上样量继续增大，条带亮度不再上升，说明抗原‑抗体结合已经饱和，此时即使背景看着尚可，也需要进一步稀释抗体。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司